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公开(公告)号：CN106086044A
公开(公告)日：2016-11-09
申请号：CN201610541306.7
申请日：2016-07-11
Applicant: 云南农业大学
CPC classification number: C07K14/005 , C12N15/66 , C12N15/746 , C12N2770/10022 , C12N2800/101
Abstract: 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建与表达，属于生物技术领域，其特征是：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆、测序，对重组质粒pMD19(simple)‑dGP5和载体pNZ8149均以Nco Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切，酶切产物纯化后以T4DNA连接酶连接；连接产物电转化至lacF基因缺失型的乳酸菌感受态NZ3900中，在LM17恢复培养基上培养，经Ellike平板筛选获得重组表达质粒pNZ8149‑dGP5；其有益效果是：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因可在乳酸乳球菌表达载体pNZ8149中进行重组，通过检测，表明外源基因GP5可以通过表达载体pNZ8149在乳酸菌中表达并具有反应原性，为下一步开发安全、有效、廉价的口服制剂提供实验依据。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN103290142A
公开(公告)日：2013-09-11
申请号：CN201310105226.3
申请日：2013-03-29
Applicant: 云南农业大学
Abstract: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准曲线建立、有效性验证和结果判定。外侧引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）用于构建标准质粒，内侧引物（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）用于样品检测，内侧引物扩增片段包含于外侧引物扩增片段之内，两对引物均能特异性扩增猪蓝耳病弱毒疫苗株病毒，扩增产物大小分别为287bp和130bp。本方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪蓝耳病病毒弱毒疫苗病毒含量的测定。
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公开(公告)号：CN103981189A
公开(公告)日：2014-08-13
申请号：CN201410211944.3
申请日：2014-05-20
Applicant: 云南农业大学
Abstract: 本发明属于分子生物学动物疾病诊断技术领域，具体涉及一种奶牛结核病候选基因CARD15基因及其功能突变检测方法。本发明提供的奶牛结核病候选基因CARD15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的奶牛结核病候选基因CARD15基因功能突变检测方法，采用上述奶牛结核病候选基因CARD15基因序列，与牛基因组序列比对，针对存在的变异，采用创造酶切位点PCR-RFLP法，用下述引物对奶牛的总DNA进行PCR扩增，然后用StyⅠ酶进行单核苷酸多态性检测，正向引物：5，CCCAGCCTGGCTAATTCACCCAAG3，,反向引物：5，TATTCCCTCAGCTCTCACCTCTAAC3，。本发明巧妙地利用创造酶切位点PCR-RFLP法检测SNPs，发现奶牛结核病候选基因CARD15基因的特异性突变位点。采用标记辅助选择是一大发展趋势。
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公开(公告)号：CN103224996A
公开(公告)日：2013-07-31
申请号：CN201310123401.1
申请日：2013-04-10
Applicant: 云南农业大学
Abstract: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测标准曲线的建立、有效性验证和结果判定。设计合成了两对引物，均能特异性扩增猪瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增产物大小为143bp，包含于前述扩增产物197bp之内,加入荧光探针SEQ ID NO.5用于Taqman荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本发明方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定。
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公开(公告)号：CN106086045A
公开(公告)日：2016-11-09
申请号：CN201610541781.4
申请日：2016-07-11
Applicant: 云南农业大学
CPC classification number: C07K14/005 , C12N15/746 , C12N2770/24322 , C12N2800/101
Abstract: 本发明提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌的方法，包括：1、猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析；2、猪瘟病毒重组表达载体PNZ44‑E2的构建；3、重组质粒PNZ44‑E2在干酪乳酸杆菌中的电转化及表达；4、重组乳酸菌免疫原性分析。其有益效果是：重组乳酸菌具有益生菌的优良特性及表达外源蛋白的双重特性，动物口服活菌后，可以发挥乳酸菌作为益生菌的保健作用及在肠道表达猪瘟E2蛋白并具有免疫作用的特性，提高机体特异性体液免疫和细胞免疫能力，通过肠道粘膜免疫增强机体对猪瘟病毒的抵抗力。利用这一平台可为益生菌工程菌株的改造及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪瘟奠定科学基础。
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公开(公告)号：CN103290142B
公开(公告)日：2015-03-11
申请号：CN201310105226.3
申请日：2013-03-29
Applicant: 云南农业大学
Abstract: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准曲线建立、有效性验证和结果判定。外侧引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）用于构建标准质粒，内侧引物（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）用于样品检测，内侧引物扩增片段包含于外侧引物扩增片段之内，两对引物均能特异性扩增猪蓝耳病弱毒疫苗株病毒，扩增产物大小分别为287bp和130bp。本方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪蓝耳病病毒弱毒疫苗病毒含量的测定。
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