公开(公告)号：CN107557383A

公开(公告)日：2018-01-09

申请号：CN201710789234.2

申请日：2017-09-05

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 侯喜林 ,  张昌伟 ,  高立伟 ,  俞静 ,  刘唱 ,  刘同坤 ,  李英 ,  郭明亮 ,  肖栋 ,  杨洋

IPC: C12N15/83 ,  A01H6/20

Abstract: 本发明公开了一种TYMV病毒诱导的十字花科内源基因沉默方法及其应用,以目标基因cDNA为模板进行PCR扩增，纯化连接载体，转化大肠杆菌，阳性克隆测序得到目的编码区全长CDS序列；根据测序后的结果选择序列为(T/A/G/C)TGA或(T/A/C)TAG或(T/A/C)TAA向后选择40bp序列；3’端加上其反向互补序列，两端再加入和线性化载体两端对应的同源序列长度为15bp的序列，合成双链DNA片段并与载体pTY-s融合连接，融合连接产物转化大肠杆菌，培养提取质粒，选择幼苗第一片真叶长出时，基因枪轰击，快速转入栽培土中培养。本发明载体构建容易，转染效率高，基因沉默效果明显，性状持久。

公开(公告)号：CN107557381A

公开(公告)日：2018-01-09

申请号：CN201710949078.1

申请日：2017-10-12

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 张昌伟 ,  杨洋 ,  侯喜林 ,  刘同坤 ,  张茹佳 ,  高立伟 ,  李英 ,  肖栋 ,  王建军 ,  胡春梅

IPC: C12N15/82 ,  C12N1/21 ,  A01H5/02

Abstract: 本发明公开了一种白菜CRISPR-Cas9基因编辑体系的建立及其应用。设计两对sgRNA引物sGAvrIIF1/sGR1和sGF2/sGAvrIIR2，分别以pChimera sgRNA vector为模板进行PCR扩增，分别取纯化目的片段以sGAvrIIF1/sGAvrIIR2为引物进行融合PCR；将载体pCAS9-TPC与融合PCR产物酶切后融合连接，融合连接产物转化大肠杆菌，获得阳性菌落进行培养提取质粒得到植物基因编辑载体。通过本发明，可简单有效的实现了对白菜的基因编辑，对白菜转基因体系的建立也奠定了良好的基础。

公开(公告)号：CN111543307A

公开(公告)日：2020-08-18

申请号：CN202010381924.6

申请日：2020-05-08

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 张昌伟 ,  侯忠乐 ,  高立伟 ,  侯喜林 ,  任一鸣 ,  肖栋 ,  刘同坤 ,  李英 ,  胡春梅

IPC: A01H1/00 ,  A01H6/20 ,  A01H5/12 ,  C12N15/82 ,  G01N21/64

Abstract: 本发明公开了一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法。该方法包含以下步骤:(1)利用聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法将CRISPR-Cas9基因编辑载体转化白菜或青花菜叶片；(2)注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况,提取有GFP荧光表达的叶片部位的基因组DNA，扩增编辑位点附近的序列测序验证编辑位点附近是否发生基因编辑,从而鉴定CRISPR-Cas9基因编辑体系的基因编辑效率。本方法解决了白菜和青花菜难以通过农杆菌侵染实现瞬时转化的问题，本发明简单有效地实现了白菜和青花菜的基因编辑，具有实验周期短，转化效率高的优点。