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公开(公告)号：CN104031853A
公开(公告)日：2014-09-10
申请号：CN201310429660.7
申请日：2013-09-22
Applicant: 西北农林科技大学 , 陕西省畜牧技术推广总站
Inventor： 张智英 , 张志强 , 辛颖 , 安宁 , 张涛 , 白义春 , 邵斯旻 , 张建峰 , 任充华 , 李铎 , 张龙 , 闫强 , 林娟 , 徐华荣 , 李欣憶 , 刘中天 , 梁明福
Abstract: 本发明公开了一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，该方法步骤为：KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建；酵母基因同源臂的插入；pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建；将MSTN载体整合入酵母基因组；抗性基因KanMX4的敲除。本发明构建了不含有筛选基因的Myostatin整合型酵母菌株，该菌种可以在富集型培养基中生产，安全可靠成本低，不会造成目的基因丢失，适合于大规模生产重组酵母，采用本发明大规模生产的酵母菌株直接饲喂动物，可在动物体内产生高水平MSTN特异性抗体，解除其抑制作用，促进肌肉生长，这对动物生产具有重要意义。
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公开(公告)号：CN106011171B
公开(公告)日：2019-10-11
申请号：CN201610333062.3
申请日：2016-05-18
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85
Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基因无缝编辑方法。该方法构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体；随后通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。
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公开(公告)号：CN106011171A
公开(公告)日：2016-10-12
申请号：CN201610333062.3
申请日：2016-05-18
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85
Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法。所述基因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5. CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体，所述CCR5‑Donor质粒载体具有pXL‑BACII‑L‑arm‑CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA ‑R‑arm结构，其中，L‑arm和R‑arm为左右同源臂，L‑arm和R‑arm中间的CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA为筛选标记组件；通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。
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公开(公告)号：CN105255937A
公开(公告)日：2016-01-20
申请号：CN201510500937.X
申请日：2015-08-14
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明是利用一个真核细胞III型启动子（U6或H1）启动由Drosha切割位点串联的多个发卡结构小RNA的表达，在真核细胞内表达后可以产生多个有生物活性的CRISPR sgRNA，以U6-sgRNA-shRNA-sgRNA的结构为例，这种U6启动表达的结构在一次转录中产生含有多个sgRNA和shRNA的初级转录本，在真核细胞中这些sgRNA经过加工后可以分别识别各自的靶位点，从而指导Cas9蛋白打靶多个位点，为多基因编辑打下基础。相比于传统的分别表达多个单一gRNA的方法和植物上新近报道的tRNA-gRNA系统，本发明的结构更简单，构建更方便。此外，本发明还可以通过Golden Gate的方法继续串联shRNA-sgRNA的序列打靶更多的位点或者表达多个shRNA干扰基因的表达。
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