公开(公告)号：CN106191116A

公开(公告)日：2016-12-07

申请号：CN201610703246.4

申请日：2016-08-22

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张智英 ,  吴芸 ,  徐坤 ,  白义春 ,  吕慧娇

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/66 ,  C12N5/10

Abstract: 本发明提供基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用，系统包括同时具有报告/供体功能的载体及Cas9表达载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序分别列位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部插入有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。本发明构建了一套能够高效定点精确靶向整合外源基因到內源基因序列的敲入系统，而且能够进行较高效率的双染色体等位基因的双敲入。

公开(公告)号：CN106011171B

公开(公告)日：2019-10-11

申请号：CN201610333062.3

申请日：2016-05-18

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张智英 ,  白义春 ,  徐坤 ,  魏泽辉 ,  和林洁 ,  任充华 ,  邵斯旻 ,  吴芸 ,  刘中天

IPC: C12N15/85

Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基因无缝编辑方法。该方法构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体；随后通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。

公开(公告)号：CN106011171A

公开(公告)日：2016-10-12

申请号：CN201610333062.3

申请日：2016-05-18

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张智英 ,  白义春 ,  徐坤 ,  魏泽辉 ,  和林洁 ,  任充华 ,  邵斯旻 ,  吴芸 ,  刘中天

IPC: C12N15/85

Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法。所述基因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5. CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体，所述CCR5‑Donor质粒载体具有pXL‑BACII‑L‑arm‑CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA ‑R‑arm结构，其中，L‑arm和R‑arm为左右同源臂，L‑arm和R‑arm中间的CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA为筛选标记组件；通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。

公开(公告)号：CN106191116B

公开(公告)日：2019-10-08

申请号：CN201610703246.4

申请日：2016-08-22

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张智英 ,  吴芸 ,  徐坤 ,  白义春 ,  吕慧娇

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/66 ,  C12N5/10

Abstract: 本发明提供基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用，系统包括同时具有报告/供体功能的载体及Cas9表达载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序分别列位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部插入有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。本发明构建了一套能够高效定点精确靶向整合外源基因到內源基因序列的敲入系统，而且能够进行较高效率的双染色体等位基因的双敲入。