公开(公告)号：CN108410907B

公开(公告)日：2021-08-27

申请号：CN201810192797.8

申请日：2018-03-08

Applicant: 湖南农业大学

Inventor： 王爱兵 ,  刘谭彬 ,  郭时印 ,  谭磊 ,  雷新诺 ,  王乃东 ,  胡意 ,  李亚兰 ,  杨凌宸 ,  杨毅

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  C12N5/10

Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。

公开(公告)号：CN108410907A

公开(公告)日：2018-08-17

申请号：CN201810192797.8

申请日：2018-03-08

Applicant: 湖南农业大学

Inventor： 王爱兵 ,  刘谭彬 ,  郭时印 ,  谭磊 ,  雷新诺 ,  王乃东 ,  胡意 ,  李亚兰 ,  杨凌宸 ,  杨毅

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  C12N5/10

Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR-gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。