公开(公告)号：CN114874964B

公开(公告)日：2023-08-25

申请号：CN202210666616.7

申请日：2022-06-13

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  刘苑琳 ,  朱莺莺

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12P19/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产2′‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明在敲除lacZ和wcaJ基因的BL21(DE3)宿主菌中，通过引入从头途径基因和编码α‑1,2‑岩藻糖基转移酶的wbgL基因来实现2′‑岩藻糖基乳糖的合成。在引入编码正转录调控因子的基因rcsA和rcsB基因来调节wbgL基因的表达，并采用强启动子PJ23119实现基因的表达。得到的重组大肠杆菌在分批发酵条件下2′‑岩藻糖基乳糖的产量最大可达9.055 g/L，在3 L发酵罐中，2′‑岩藻糖基乳糖的产量达到79.23 g/L，是迄今报道的最高值，在大规模工业应用中表现出显著的生产潜力。

公开(公告)号：CN116536232A

公开(公告)日：2023-08-04

申请号：CN202310372381.5

申请日：2023-04-10

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  赵明利 ,  李泽宇 ,  张文立

IPC: C12N1/21 ,  A23L33/125 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/56 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N15/70 ,  C12P19/26 ,  A61K35/74 ,  A61K31/702 ,  A61P31/12 ,  A61P37/02 ,  A61P1/00 ,  A61P31/00 ,  A61P43/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明在大肠杆菌基因组上整合尿苷二磷酸半乳糖‑4‑差向异构酶编码基因galE，在基因组IS186多拷贝基因座上插入β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶编码基因lgtA，游离表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶编码基因wbgO使底物乳糖转化为乳酰‑N‑四糖。发现鸟苷二磷酸‑岩藻糖的从头合成途径利于乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的生产。本发明筛选到既能够提高乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的产量，又能避免副产物2′‑岩藻糖基乳糖的生成的α1,2‑岩藻糖基转移酶WbsJ。本发明提供的重组大肠杆菌摇瓶发酵产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ达2.53g/L，5L发酵罐产量达30.47g/L，为进一步工业化生产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ奠定了基础。

公开(公告)号：CN116376887A

公开(公告)日：2023-07-04

申请号：CN202310155281.7

申请日：2023-02-22

Applicant: 江南大学 ,  中国科学院天津工业生物技术研究所

Inventor： 张文立 ,  沐万孟 ,  任虎 ,  李瑾 ,  徐炜 ,  朱莺莺 ,  倪大伟 ,  石婷

IPC: C12N9/90 ,  A23L33/125 ,  A21D2/18 ,  A21D13/062 ,  C12N15/61 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  A61K38/52 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高酶活D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体及其应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明以来源于Thermoclostridium caenicola的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为亲本，利用基因突变技术，将第258位的半胱氨酸突变为组氨酸，获得单点突变体C258H，其酶活得到了提高，由野生型酶的242.4U/mg提高到387.8U/mg，增加了60.0％。这一发现对于工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的研究价值。

公开(公告)号：CN115960875A

公开(公告)日：2023-04-14

申请号：CN202211326490.5

申请日：2022-10-27

Applicant: 江南大学

Inventor： 张文立 ,  王鑫绣 ,  徐炜 ,  光翠娥 ,  沐万孟

IPC: C12N9/88 ,  C12N15/60 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶，属于酶的基因工程技术领域。本发明提供的突变体酶是将来源于Paenibacillussp.YN15的褐藻胶裂解酶的第48位的赖氨酸突变为脯氨酸，第106位的酪氨酸突变为甘氨酸，第172位的丝氨酸突变为缬氨酸，第190位的丝氨酸突变为甘氨酸。突变体酶的热稳定性和结构稳定性得到了提高：55℃下保持8h酶活仍能坚持60％以上。多点突变体的最适温度上升到65‑70℃，与野生型酶相比提高了10℃以上。在最适催化条件下，酶催化底物海藻酸钠生产褐藻寡糖的相对酶活无明显下降，具有重要的工业应用价值。

公开(公告)号：CN113186142B

公开(公告)日：2023-01-31

申请号：CN202110389910.3

申请日：2021-04-12

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  万李 ,  朱莺莺

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12P19/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种高效生产2′‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。本发明以甘油为碳源，乳糖和L‑岩藻糖为底物，通过引入自组装短肽介导通路关键酶Fkp和FutC组装结合成酶复合物，从而减少代谢中间产物的流失提高产物生产效率，提高产物2′‑FL生产产量和产率。此外，还通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，同时加强代谢通路中的辅因子的循环再生进一步提高2′‑FL的产量。使得到的大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐条件下分批补料64小时可积累30.5g/L的2′‑FL，摩尔产率为0.661mol2′‑FL/mol岩藻糖和0.495mol2′‑FL/mol乳糖。对于工业化生产2′‑FL具有重要意义。

公开(公告)号：CN115369106A

公开(公告)日：2022-11-22

申请号：CN202211141161.3

申请日：2022-09-20

Applicant: 江南大学

Inventor： 徐炜 ,  沐万孟 ,  方媛媛 ,  张文立

IPC: C12N11/04 ,  C12N11/14 ,  C12N9/18 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种有效提高玉米赤霉烯酮内酯水解酶耐酸稳定性的固定化方法及应用，属于生物技术领域。本发明使用注射凝胶法将ZEN水解酶封装在基于卡拉胶钾的水凝胶珠中，酶的酸稳定性通过与碱性缓冲剂Mg(OH)2的共同封装得以提高。本发明所获得的Mg(OH)2缓冲液在中性条件下是不溶的，但当氢离子扩散到水凝胶珠中时会溶解，从而确保中性的内部pH值。采用含有Mg(OH)2缓冲剂的水凝胶珠共封装体系使得ZEN水解酶在酸性环境中的稳定性得到改善，适用于酸敏感酶的ZEN水解酶食品级递送系统，具有工业应用的潜力。

公开(公告)号：CN115125232A

公开(公告)日：2022-09-30

申请号：CN202210706492.0

申请日：2022-06-21

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  徐炜 ,  孙闽文 ,  张文立

IPC: C12N11/089 ,  C12N9/16 ,  C12N15/70 ,  C12N15/55 ,  C12Q1/42 ,  G01N21/64

Abstract: 本发明公开了一种基于固定化有机磷水解酶的有机磷农药残留物灵敏检测方法，属于甲基对硫磷检测技术领域。本发明利用金属有机框架MIL‑88A固定甲基对硫磷水解酶Azau‑MPH，并联合AMC荧光探针实现了甲基对硫磷的快速检测。此外，本申请的固定化酶还具有良好的储藏稳定性，在4℃储藏60天后，固定化酶仍然有80％的活性保留，并且固定化酶在60℃下的热稳定性显著提高，从而使得本申请得到的固定化有机磷水解酶具有更高的应用价值。

公开(公告)号：CN112680426B

公开(公告)日：2022-09-06

申请号：CN202011580654.8

申请日：2020-12-28

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  田雨晴 ,  徐炜 ,  陈秋铭

IPC: C12N9/10 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/04 ,  C12P19/18 ,  A23L29/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体，属于酶工程领域。本发明将来源于微生物Calidithermus timidus DSM 17022的淀粉蔗糖酶(简称CT‑ASase)作为亲本，构建了四点突变体酶L382P/S414N/P618I/H631K(简称M45)。M45在65℃的半衰期由原来的23.58h提高到43.72h，在70℃的半衰期由原来的71min提高到110min，熔融温度由原来的74.29℃提高到76.44℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃。这一发现对于工业化制备纯直链淀粉及转糖苷酶的工业化应用有重要的研究价值。

公开(公告)号：CN114874966A

公开(公告)日：2022-08-09

申请号：CN202210677909.5

申请日：2022-06-15

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  张嘉萌 ,  朱莺莺

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/56 ,  C12N15/54 ,  C12N15/61 ,  C12N15/60 ,  C12P19/26 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产3′‑唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。本发明以甘油为碳源，乳糖为底物，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，过表达glmM、glmU、glmS*，引入外源neuBCA途径，筛选新的α2,3‑SiaT并对其进行改造，鉴定和表征,进一步提高3′‑SL的产量。此外，还使得到的大肠杆菌工程菌株在5L发酵罐条件下分批补料38.5h可积累31.4g/L的3′‑SL，对于工业化生产3′‑SL具有重要意义。

公开(公告)号：CN113652385A

公开(公告)日：2021-11-16

申请号：CN202110900124.5

申请日：2021-08-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  朱莺莺 ,  李泽宇

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12N9/12 ,  C12N15/61 ,  C12N15/55 ,  C12N15/56 ,  C12N15/70 ,  C12P19/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。