公开(公告)号：CN108588113A

公开(公告)日：2018-09-28

申请号：CN201810368251.3

申请日：2018-04-23

Applicant: 西南大学

Inventor： 宋震 ,  崔甜甜 ,  宾羽 ,  晏建红 ,  李中安 ,  周常勇

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/70 ,  C12N15/66

Abstract: 本发明公开了一种三元穿梭载体pTY，其序列如SEQ ID NO:11所示。还公开了一种利用pTY构建柑桔黄化脉明病毒(CYVCV)侵染性克隆的方法，包括如下步骤：(1)制备CYVCV全长cDNA；(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:11所示三元穿梭载体pTY，得到pTY线性化的载体；(3)酵母转化伴随的同源重组：采用醋酸锂法将线性化载体pTY与CYVCV全长cDNA共转化酵母菌YPH501；(4)侵染性克隆鉴定：同源重组质粒转化农杆菌C58C1，筛选获得CYVCV侵染性克隆。本发明有效克服了病毒全长cDNA片段在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象。

公开(公告)号：CN108531502A

公开(公告)日：2018-09-14

申请号：CN201810367772.7

申请日：2018-04-23

Applicant: 西南大学

Inventor： 宋震 ,  崔甜甜 ,  宾羽 ,  晏建红 ,  李中安 ,  周常勇

IPC: C12N15/81 ,  C12N15/82 ,  C12N15/40 ,  A01G7/06 ,  C12R1/94

Abstract: 本发明公开了一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，步骤：(1)三个覆盖CTV基因组全长特异片段CTV1、CTV2、CTV3的长链RT-PCR扩增；(2)三元穿梭载体pCY线性化；(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CTV1、CTV2、CTV3回收片段和线性化的三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501；(4)转化农杆菌；(5)农杆菌介导接种，从而鉴定获得CTV侵染性克隆。还公开了侵染性克隆的接种方法：(1)播种：柑桔种子剥去外种皮播于培养基，暗培养；2)离心收集携带CTV侵染性克隆与Hc-Pro或P19表达质粒的农杆菌细胞，用接种缓冲液悬浮；(3)真空浸润；(4)暗培养。

公开(公告)号：CN108559759A

公开(公告)日：2018-09-21

申请号：CN201810367775.0

申请日：2018-04-23

Applicant: 西南大学

Inventor： 宋震 ,  崔甜甜 ,  宾羽 ,  晏建红 ,  李中安 ,  周常勇

IPC: C12N15/82 ,  C12N15/70 ,  C12N15/66

Abstract: 本发明公开了一种三元穿梭载体pCY，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。还公开了一种构建CLBV侵染性克隆的方法：(1)提取感染CLBV植株总RNA，反转录后采用pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的特异片段CLBV1、CLBV2；(2)用Stu I、Sma I酶切pCY；(3)TAR克隆：采用醋酸锂法将CLBV1、CLBV2和线性化pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV全长cDNA克隆pCY-CLBV；(4)pCY-CLBV质粒转化农杆菌，接种柑桔或本生烟，鉴定获得CLBV侵染性克隆。