公开(公告)号：CN117431223A

公开(公告)日：2024-01-23

申请号：CN202311387587.1

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  王培霞 ,  曾川 ,  沈金燕 ,  唐玉新 ,  黄冬艳 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N15/38 ,  C12N15/85 ,  C12N15/113 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了利用腺嘌呤碱基编辑器制备gE和gI双基因缺失PRV毒株的方法及应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE和gI基因的起始密码子作为靶标位点，设计四条sgRNA序列，根据sgRNA序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将pU6‑sgRNA‑Puro‑2A‑EGFP载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与上述带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物；将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染至Vero81细胞中，转染后，吸取病毒液，离心收集上清液。本发明的构建方法效率高，对病毒基因的改变小，不容易引起病毒的变异，成本低。

公开(公告)号：CN117106736A

公开(公告)日：2023-11-24

申请号：CN202311385914.X

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  顾俊 ,  曾川 ,  沈金燕 ,  王培霞 ,  唐玉新 ,  王妮 ,  白雨溦 ,  黄冬艳 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N7/04 ,  C12N15/85 ,  C12N15/38 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE、TK、gI三基因作为靶标位点，设计sgRNA序列，根据sgRNA上下游序列分别合成单链寡核苷酸，然后退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物；将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染，对通过转染获得的病毒进行蚀斑纯化，每一轮均通过PCR扩增与测序的方法进行验证；纯化得到单克隆毒株；本发明方法效率高，对病毒基因的改变小，不引起病毒基因组出现大的结构变异，成本低。

公开(公告)号：CN117431222A

公开(公告)日：2024-01-23

申请号：CN202311387432.8

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  王培霞 ,  黄冬艳 ,  曾川 ,  沈金燕 ,  唐玉新 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N15/38 ,  C12N15/85 ,  C12N15/113 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了利用腺嘌呤碱基编辑器制备gE、gI和TK三基因缺失PRV毒株的方法与应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE、gI和TK基因的起始密码子作为靶标位点，设计七条sgRNA序列，根据sgRNA序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将pU6‑sgRNA‑Puro‑2A‑EGFP载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与上述带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物，将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染至Vero81细胞中，转染后，吸取病毒液，离心收集上清液。本发明的方法效率高，对病毒基因的改变小，不容易引起病毒的变异，成本低。

公开(公告)号：CN117106736B

公开(公告)日：2024-02-20

申请号：CN202311385914.X

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  顾俊 ,  曾川 ,  沈金燕 ,  王培霞 ,  唐玉新 ,  王妮 ,  白雨溦 ,  黄冬艳 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N7/04 ,  C12N15/85 ,  C12N15/38 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE、TK、gI三基因作为靶标位点，设计sgRNA序列，根据sgRNA上下游序列分别合成单链寡核苷酸，然后退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物；将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染，对通过转染获得的病毒进行蚀斑纯化，每一轮均通过PCR扩增与测序的方法进行验证；纯化得到单克隆毒株；本发明方法效率高，对病毒基因的改变小，不引起病毒基因组出现大的结构变异，成本低。

公开(公告)号：CN117126818B

公开(公告)日：2024-02-02

申请号：CN202311385572.1

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  王培霞 ,  唐玉新 ,  曾川 ,  顾俊 ,  沈金燕 ,  段艺文 ,  白雨溦 ,  黄冬艳 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N7/04 ,  C12N15/38 ,  C12N15/85 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 少。本发明公开了利用ABE构建gE基因缺失PRV毒株的方法和应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE基因的起始密码子作为靶标位点，设计sgRNA序列，根据sgRNA序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物，再转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染，转染24h后，吸取病毒液，离心收集上清

公开(公告)号：CN117126818A

公开(公告)日：2023-11-28

申请号：CN202311385572.1

申请日：2023-10-25

Applicant: 江西农业大学

Inventor： 叶昱 ,  王培霞 ,  唐玉新 ,  曾川 ,  顾俊 ,  沈金燕 ,  段艺文 ,  白雨溦 ,  黄冬艳 ,  宋德平

IPC: C12N7/01 ,  C12N7/04 ,  C12N15/38 ,  C12N15/85 ,  A61K39/245 ,  A61P31/22 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了利用ABE构建gE基因缺失PRV毒株的方法和应用，涉及生物技术领域，选择PRV病毒中gE基因的起始密码子作为靶标位点，设计sgRNA序列，根据sgRNA序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链DNA片段，将载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与带粘性末端的双链DNA片段连接，获得连接产物，再转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；将质粒转染，转染24h后，吸取病毒液，离心收集上清液。本发明的PRV毒株不存在结构变异，仅是修改少量ATG的中A或T的碱基，就能够实现gE表达的终止，而且该序列潜在的调控作用受到的影响最少。