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公开(公告)号：CN107043764A
公开(公告)日：2017-08-15
申请号：CN201611215943.1
申请日：2016-12-26
Applicant: 扬州大学
CPC classification number: C12N15/1055 , G01N33/6848
Abstract: 本发明公开了一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法：（1）目的基因克隆以及原核表达载体构建；（2）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建；（3）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因进行原核表达；（4）对蛋白进行大量表达和破菌检测；（5）明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST‑Pull Down试验；（6）GST‑Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC‑MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。本发明能够较快的获得相关基因的互作蛋白；方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
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公开(公告)号：CN104805118A
公开(公告)日：2015-07-29
申请号：CN201510195632.2
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除的方法：首先查询出基因的外显子序列，克隆出基因，测序，获得完整的外显子序列，并在此序列上设计CRISPR/Cas9敲除靶位点作为gRNA，构建CRISPR/Cas9双启动子敲除载体；构建完成的Cas9载体进行SSA活性检测，对照组转染空载体，检测luciferase信号，luciferase活性相对于对照组增长的越多，则证明gRNA剪切活性越高；将具有高SSA活性的CRISPR/Cas9载体转染ESCs，流式细胞术筛选出GFP阳性细胞，提取基因组DNA，设计引物。
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公开(公告)号：CN105821116A
公开(公告)日：2016-08-03
申请号：CN201610237236.6
申请日：2016-04-15
Applicant: 扬州大学
CPC classification number: C12Q1/66 , C12Q1/44 , G01N33/68 , G01N2333/47
Abstract: 本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)目的基因克隆；(2)gRNA设计及合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测。本发明的优越性在于：1、实验周期较短速；2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3、运用该方法构建的活性载体，毒副作用小，可用于转基因动物的制备与生产；4、该方法非特异剪切较少，显著提高了基因靶向敲除效率高。5、该方法适用性高。
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公开(公告)号：CN104762265A
公开(公告)日：2015-07-08
申请号：CN201510195770.0
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
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公开(公告)号：CN105838667B
公开(公告)日：2019-10-18
申请号：CN201610252413.8
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/0735 , C12N5/073 , C12Q1/6851 , G01N33/68
Abstract: 本发明公开了一种TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109761，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109761+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：LY2109761，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN108949921A
公开(公告)日：2018-12-07
申请号：CN201810916667.4
申请日：2018-08-13
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/6851 , G01N33/68
CPC classification number: C12Q1/6851 , G01N33/68 , C12Q2521/107 , C12Q2563/107 , C12Q2531/113
Abstract: 本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，涉及一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，包括如下步骤：Stra8基因3’UTR序列的获得；Stra8基因靶向miRNA预测；最佳miRNA筛选；验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；体内验证miRNA对公鸡生精的影响。相对于现有技术，本发明本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证Stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对Stra8基因进行抑制，以便更好在SSC中进行基因功能验证。
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公开(公告)号：CN105838791A
公开(公告)日：2016-08-10
申请号：CN201610252399.1
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/68
CPC classification number: C12Q1/6869 , C12Q2537/165 , C12Q2535/122
Abstract: 本发明公开了一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法，本方法首先从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睾丸，分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs,并根据CDH1基因设计特异性，以PCR扩增的方法进行性别鉴定，对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选,阳性细胞提取细胞总RNA，纯化后对RNA质量进行检测，检测合格后进行RNA?Seq测序。将测序结果中筛选出组装RNA的转录本。分离鸡ESCs，PGCs和SSCs，提取总RNA，反转录为cDNA。对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析，并通过DAVID数据库查找其GO功能项，再通过GO分析注释其功能，对其进行功能分析。绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。
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公开(公告)号：CN109022546A
公开(公告)日：2018-12-18
申请号：CN201810849163.5
申请日：2018-07-28
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/6851 , C12Q1/66 , G01N33/68
CPC classification number: C12Q1/6851 , C12Q1/66 , G01N33/68 , C12Q2531/113 , C12Q2563/107 , C12Q2561/113
Abstract: 本发明公开了一种Nanos2启动子核心区域关键转录因子的验证方法：首先，对Nanos2 5’侧翼区序列进行PCR扩增，构建真核表达载体pNanos2‑EGFP，将pNanos2‑EGFP、pEGFP‑N1、pLinker‑EGFP分别转染DF‑1细胞，以对Nanos2启动子区定性分析；分别构建启动子5’端不同长度缺失载体pGL3‑1187、pGL3‑959、pGL3‑788、pGL3‑493、pGL3‑155与pRL‑SV40共转染DF‑1细胞，进行双荧光素酶报告基因检测以对Nanos2启动子核心区域进行鉴定，构建缺失核心区域载体，再次进行双荧光素酶活性分析，观察是否缺失核心区域后启动子活性丧失或显著降低；对Nanos2启动子核心区域进行转录因子结合位点预测，进行双荧光素酶报告分析和CHIP试验确定关键转录因子。通过细胞形态学观察、qRT‑PCR、细胞免疫化学、流式细胞分析等方法检测雄性生殖细胞分化情况。
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公开(公告)号：CN109022484A
公开(公告)日：2018-12-18
申请号：CN201810889239.7
申请日：2018-08-07
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N15/85 , C12N15/90 , C12N9/22 , G01N33/569
CPC classification number: C12N15/85 , C12N9/22 , C12N15/902 , G01N33/56966
Abstract: 本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术，能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。
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公开(公告)号：CN105838667A
公开(公告)日：2016-08-10
申请号：CN201610252413.8
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/0735 , C12N5/073 , C12Q1/68 , G01N33/68
Abstract: 本发明公开了一种新的TGF?β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA?seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF?β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。
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