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公开(公告)号：CN107043764A
公开(公告)日：2017-08-15
申请号：CN201611215943.1
申请日：2016-12-26
Applicant: 扬州大学
CPC classification number: C12N15/1055 , G01N33/6848
Abstract: 本发明公开了一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法：（1）目的基因克隆以及原核表达载体构建；（2）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建；（3）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因进行原核表达；（4）对蛋白进行大量表达和破菌检测；（5）明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST‑Pull Down试验；（6）GST‑Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC‑MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。本发明能够较快的获得相关基因的互作蛋白；方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
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公开(公告)号：CN104805118A
公开(公告)日：2015-07-29
申请号：CN201510195632.2
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除的方法：首先查询出基因的外显子序列，克隆出基因，测序，获得完整的外显子序列，并在此序列上设计CRISPR/Cas9敲除靶位点作为gRNA，构建CRISPR/Cas9双启动子敲除载体；构建完成的Cas9载体进行SSA活性检测，对照组转染空载体，检测luciferase信号，luciferase活性相对于对照组增长的越多，则证明gRNA剪切活性越高；将具有高SSA活性的CRISPR/Cas9载体转染ESCs，流式细胞术筛选出GFP阳性细胞，提取基因组DNA，设计引物。
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公开(公告)号：CN105838667B
公开(公告)日：2019-10-18
申请号：CN201610252413.8
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/0735 , C12N5/073 , C12Q1/6851 , G01N33/68
Abstract: 本发明公开了一种TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109761，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109761+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：LY2109761，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN104745527B
公开(公告)日：2018-01-05
申请号：CN201510193606.6
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/073
Abstract: 本发明公开了一种新的快速鸡胚盘的分离方法：首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一个小孔后，将镊子一端插入小孔，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应尽量保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；剥离蛋壳后，用镊子将蛋清从卵黄中分离；使用镊子的侧面拨动卵黄，寻找胚盘；找到胚盘后，尽量将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈正方形剪开，此时，使用镊子夹住将含有胚盘的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，将此卵黄膜放入37℃的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿,使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。
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公开(公告)号：CN105821116A
公开(公告)日：2016-08-03
申请号：CN201610237236.6
申请日：2016-04-15
Applicant: 扬州大学
CPC classification number: C12Q1/66 , C12Q1/44 , G01N33/68 , G01N2333/47
Abstract: 本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)目的基因克隆；(2)gRNA设计及合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测。本发明的优越性在于：1、实验周期较短速；2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3、运用该方法构建的活性载体，毒副作用小，可用于转基因动物的制备与生产；4、该方法非特异剪切较少，显著提高了基因靶向敲除效率高。5、该方法适用性高。
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公开(公告)号：CN104762265A
公开(公告)日：2015-07-08
申请号：CN201510195770.0
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
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公开(公告)号：CN104745527A
公开(公告)日：2015-07-01
申请号：CN201510193606.6
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/073
Abstract: 本发明公开了一种新的快速鸡胚盘的分离方法：首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一个小孔后，将镊子一端插入小孔，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应尽量保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；剥离蛋壳后，用镊子将蛋清从卵黄中分离；使用镊子的侧面拨动卵黄，寻找胚盘；找到胚盘后，尽量将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈正方形剪开，此时，使用镊子夹住将含有胚盘的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，将此卵黄膜放入37℃的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿,使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。
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公开(公告)号：CN105838667A
公开(公告)日：2016-08-10
申请号：CN201610252413.8
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/0735 , C12N5/073 , C12Q1/68 , G01N33/68
Abstract: 本发明公开了一种新的TGF?β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA?seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF?β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。
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