公开(公告)号：CN119020269A

公开(公告)日：2024-11-26

申请号：CN202410927512.6

申请日：2024-07-11

Applicant: 扬州大学

Inventor： 左其生 ,  王梓羽 ,  龚威 ,  张亚妮 ,  靳锴 ,  牛英杰 ,  姚泽令 ,  李碧春

IPC: C12N5/0735 ,  C12Q1/02

Abstract: 本发明公开一种研究类泛素化修饰调节鸡原始生殖细胞特性的方法，包括：采用VII‑31和MLN4924处理PGCs；PGCs生物学特性的检测。本发明方法简便高效、特异性强，填补了类泛素化修饰对鸡PGCs特性调节作用研究的空白，为体外长期维持鸡PGCs的生物学特性提供理论基础，以期在体外培养扩增解决体外获取数量不足的问题进而更好地实现鸡PGCs的高效利用；解决缺乏研究类泛素化修饰调节鸡PGCs特性的问题，为制定鸡PGCs体外长期培养扩增方案提供研究基础；采用本方法，可研究类泛素化修饰对鸡PGCs特性的调节作用，便于深入研究鸡PGCs生物学特性维持机制，为PGCs的发生机制研究和具体应用作铺垫。

公开(公告)号：CN116042715A

公开(公告)日：2023-05-02

申请号：CN202310028001.6

申请日：2023-01-09

Applicant: 扬州大学 ,  江苏省家禽科学研究所

Inventor： 靳锴 ,  李新林 ,  高晓敏 ,  薛倩 ,  韩威 ,  李碧春 ,  左其生 ,  张亚妮 ,  牛英杰 ,  孙红艳

IPC: C12N15/85

Abstract: 本发明提供了一种鸡TDRD1基因启动子区域组蛋白甲基化水平的调控方法，属于基因编辑技术领域。本发明的方法包括如下步骤：(1)设计并扩增得到靶向鸡TDRD1基因启动子区域的sgRNA；(2)将酶切后的dCas9‑LSD1载体与步骤(1)的sgRNA连接，得到具有靶向性的dCas9‑LSD1打靶载体；(3)将所述dCas9‑LSD1打靶载体转染入细胞中，来调控鸡TDRD1基因启动子区域组蛋白甲基化水平。本发明构建的dCas9‑LSD1打靶载体可以作用于特定基因局部的启动子区位点，可以调控区域性的组蛋白甲基化水平，还可以明确在鸡SSC发育过程中组蛋白甲基化修饰区域。

公开(公告)号：CN113278686A

公开(公告)日：2021-08-20

申请号：CN202110651752.4

申请日：2021-06-11

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  张晨 ,  左其生 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6851 ,  G01N33/68 ,  G01N33/58 ,  G01N21/64 ,  G01N1/30 ,  G01N21/84

Abstract: 本发明涉及一种研究DNA甲基化调控重编程过程的方法，包括以下步骤：步骤（1）、在山中因子Oct4、Sox2、Klf4及c‑Myc诱导的基础上添加DNA甲基化酶抑制剂5’aza，按照山中伸弥提供的诱导方法对体细胞进行诱导，在不同诱导天数观察细胞形态；步骤（2）、当观察到出现细胞克隆时收集细胞进行荧光定量检测、间接免疫荧光检测、碱性磷酸酶染色、染色体核型分析和edu增殖检测；步骤（3）、确定5’aza的效果后，将四因子和5’aza分别进行组合处理体细胞进行诱导，检测ips克隆的形成，确定最有效的组合形式。通过本发明，通过山中因子和DNA甲基化抑制剂5’aza的不同组合诱导，探明DNA甲基化在体细胞重编程诱导中的作用。

公开(公告)号：CN111826430A

公开(公告)日：2020-10-27

申请号：CN202010724836.1

申请日：2020-07-24

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  张晨 ,  左其生 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6876 ,  G16B25/10 ,  G16B30/00

Abstract: 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，属于生物技术领域。通过生物信息学分析将RNA-seq和CHIP-seq联合筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化酶共同调控的靶基因，为研究PGCs形成的表观遗传和遗传机制网络提供参考。

公开(公告)号：CN111763722A

公开(公告)日：2020-10-13

申请号：CN202010731512.0

申请日：2020-07-27

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  袁霞 ,  左其生 ,  姜景译 ,  丁颖 ,  石祥 ,  张明 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6869 ,  C12Q1/6888 ,  C12N15/89

Abstract: 一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，属于生物技术领域。本发明的通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的研究方法切实可靠，严谨准确，成效显著，为CEF转分化形成的PGC-like细胞介导产生的后代鸡的鉴定工作提供了一种新颖可行且高效的实验方法。

公开(公告)号：CN110343752A

公开(公告)日：2019-10-18

申请号：CN201910593543.1

申请日：2019-07-03

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  张晨 ,  左其生 ,  王曼 ,  金晶 ,  李婷婷 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6869 ,  G01N33/68 ,  C12N15/867

Abstract: 本发明提供一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法，涉及生物技术领域，所述方法通过体内外实验验证组蛋白是否具有调控Wnt信号通路的靶基因的作用、分析在ESCs、PGCs和SSCs三个过程组蛋白是否在靶基因的启动子区差异性富集、检测组蛋白甲基化/去甲基化是否影响靶基因对Wnt信号的响应、检测组蛋白去甲基化修饰酶对β-Catenin与靶基因启动子结合位点的结合能力的影响；根据检测结果判断在PGCs分化过程中，Wnt信号联合组蛋白作用于靶基因的作用机制。利用本发明所述方法对PGCs形成过程中Wnt信号协同组蛋白作用于靶基因进行研究，有利于渗入了解PGCs形成的网络机制。

公开(公告)号：CN109837238A

公开(公告)日：2019-06-04

申请号：CN201910165488.6

申请日：2019-03-05

Applicant: 扬州大学

Inventor： 金晶 ,  赵瑞丰 ,  张晨 ,  李碧春 ,  张亚妮 ,  左其生 ,  孙红艳

IPC: C12N5/073 ,  C12R1/91

Abstract: 本发明涉及一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法，属于生物技术领域。在注射管中塞入干净干燥的棉球，将针管式滤器的大头连接注射器的针口，将橡皮管一头连接针管式滤器的小头，另一头连接处理过后的玻璃管，用于直接挑取细胞。本发明中口吸管采用的材料均容易购买，且价格低廉。组装完成后，成品操作简单，使用者可以挑取特定单个细胞进行单克隆培养，所采用的重组口吸管适用于所有类型的细胞。

公开(公告)号：CN109022546A

公开(公告)日：2018-12-18

申请号：CN201810849163.5

申请日：2018-07-28

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  张文慧 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  王曼

IPC: C12Q1/6851 ,  C12Q1/66 ,  G01N33/68

CPC classification number: C12Q1/6851 ,  C12Q1/66 ,  G01N33/68 ,  C12Q2531/113 ,  C12Q2563/107 ,  C12Q2561/113

Abstract: 本发明公开了一种Nanos2启动子核心区域关键转录因子的验证方法：首先，对Nanos2 5’侧翼区序列进行PCR扩增，构建真核表达载体pNanos2‑EGFP，将pNanos2‑EGFP、pEGFP‑N1、pLinker‑EGFP分别转染DF‑1细胞，以对Nanos2启动子区定性分析；分别构建启动子5’端不同长度缺失载体pGL3‑1187、pGL3‑959、pGL3‑788、pGL3‑493、pGL3‑155与pRL‑SV40共转染DF‑1细胞，进行双荧光素酶报告基因检测以对Nanos2启动子核心区域进行鉴定，构建缺失核心区域载体，再次进行双荧光素酶活性分析，观察是否缺失核心区域后启动子活性丧失或显著降低；对Nanos2启动子核心区域进行转录因子结合位点预测，进行双荧光素酶报告分析和CHIP试验确定关键转录因子。通过细胞形态学观察、qRT‑PCR、细胞免疫化学、流式细胞分析等方法检测雄性生殖细胞分化情况。

公开(公告)号：CN109022484A

公开(公告)日：2018-12-18

申请号：CN201810889239.7

申请日：2018-08-07

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  张文慧 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  王曼 ,  程少泽 ,  汪怡临 ,  何娜娜

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  C12N9/22 ,  G01N33/569

CPC classification number: C12N15/85 ,  C12N9/22 ,  C12N15/902 ,  G01N33/56966

Abstract: 本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术，能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。

公开(公告)号：CN105838667A

公开(公告)日：2016-08-10

申请号：CN201610252413.8

申请日：2016-04-21

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  左其生 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  汤贝贝 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12N5/0735 ,  C12N5/073 ,  C12Q1/68 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明公开了一种新的TGF?β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA?seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF?β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。