公开(公告)号：CN110714008A

公开(公告)日：2020-01-21

申请号：CN201910985414.7

申请日：2019-10-17

Applicant: 南通大学

Inventor： 吴刘成 ,  华益民 ,  朱顺星 ,  邵义祥 ,  孙俊杰 ,  刘春 ,  王旭

IPC: C12N15/113 ,  C12N15/63 ,  C12N15/66 ,  C12N15/90

Abstract: 本发明提供一种核苷酸序列构建的CRISPR重组质粒靶向编辑ISS序列的方法，步骤为：靶向设计sgRNAqingqin oligo序列，两端加BsmBI质粒酶切位点，构建重组质粒，转化，铺板，挑单克隆，提质粒，测序，序列比对，经鉴定，构建成功。本发明采用CRISPR case 9 sgRNAqingqin重组质粒，可以精准靶向编辑（包括删除、插入及突变）ISS序列，也可以达到使剪接沉默子ISS序列失去作用或作用减弱的效果，从而显著促进SMN2外显子7列入，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达发挥作用，一次性转染即可，是治疗相关遗传性疾病最有潜力的方法。

公开(公告)号：CN112481272A

公开(公告)日：2021-03-12

申请号：CN202011535839.7

申请日：2020-12-23

Applicant: 南通大学

Inventor： 吴刘成 ,  孙俊杰 ,  华益民 ,  邵义祥 ,  朱顺星

IPC: C12N15/12 ,  C12N15/86 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

Abstract: 本发明提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，验证方法包括如下步骤：（1）RT‑PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；（5）证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入；（6）构建小鼠模型，证实NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。本发明证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。

公开(公告)号：CN114107190A

公开(公告)日：2022-03-01

申请号：CN202111467078.0

申请日：2021-12-02

Applicant: 南通大学

Inventor： 吴刘成 ,  华益民 ,  朱顺星 ,  刘春 ,  王旭 ,  邵义祥

IPC: C12N5/0775 ,  C12Q1/02 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明属于生物医疗技术领域，本发明公开了一种SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的建立方法，包括以下步骤：通过对SMA模型小鼠进行基因型鉴定，选取基因型为SMA小鼠BMMSC提取分离，用培养基培养，次日进行换液；倒置显微镜观察细胞形态，待其长满后用胰酶消化，进行传代继续培养；F3代细胞用于后续实验。本发明还公开了SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定试剂盒，另外还公开了本发明所构建的SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的应用，本发明首次利用原代培养的SMA小鼠骨髓间充质干细胞，原代细胞呈梭形，仅有两个拷贝的SMN2基因，无SMN1基因的干扰，因其来源于SMA小鼠自身，是脊髓性肌萎缩小鼠体外最真实的模拟。