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公开(公告)号：CN114958900A
公开(公告)日：2022-08-30
申请号：CN202210528110.X
申请日：2022-05-16
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母无标记整合载体及其应用用，属于微生物基因工程领域。该整合载体包括重组反应区，重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列。本发明仅需单个载体即可高效便捷地实现基因的无标记整合，为在解脂耶氏酵母体内整合多个基因提供了极大的便利。
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公开(公告)号：CN110408645B
公开(公告)日：2021-01-08
申请号：CN201910747704.8
申请日：2019-08-14
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明涉及一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法，属于基因工程技术领域。本发明所述系统通过质粒1转化解脂耶氏酵母能够引入lox位点，而后通过质粒2和质粒3依次转化，能够实现目的基因任意次数无痕整合到解脂耶氏酵母基因组。本发明仅需一个酵母筛选标记即可实现目的基因任意次数的整合，同时，本发明极大地降低了非目的基因的引入，且每次整合后的基因组均是已知可控的，这有利于解脂耶氏酵母表达系统在食品、医药、农产品加工等领域的应用。
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公开(公告)号：CN118374535A
公开(公告)日：2024-07-23
申请号：CN202410528445.0
申请日：2024-04-29
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种毕赤酵母高效无痕基因敲除载体及其应用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母高效无痕基因敲除载体包括两个不同条件诱导的压力基因表达盒、筛选基因表达盒、待敲除片段的上、下游同源序列及该片段内部同源序列；本发明中敲除载体单交换整合入目的位点后，通过引导两轮分子内重组后即可高效地实现基因无痕敲除。本发明不需抑制NEHJ途径，仅需单个载体即可非常高效地实现毕赤酵母中基因的无痕敲除。
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公开(公告)号：CN113088533B
公开(公告)日：2023-03-24
申请号：CN202110405939.6
申请日：2021-04-15
Applicant: 华中科技大学
IPC: C12N15/81 , C12N1/19 , C07K14/435 , C12R1/84
Abstract: 本发明公开了表达粘胶蛋白的载体、酵母工程菌和方法，属于蛋白制备技术领域。本发明基于毕赤酵母表达系统，通过提高拷贝数、融合脂肪酶、增加辅助因子等技术手段，并优化了菌液培养基初始pH值、接种量、甲醇添加量、诱导时间、诱导温度等参数，将粘胶蛋白表达量提升到克级，满足了规模化生产应用的需要。进一步地，本发明还公开了用于表达粘胶蛋白的表达载体和酵母工程菌。
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公开(公告)号：CN115418371A
公开(公告)日：2022-12-02
申请号：CN202210974824.3
申请日：2022-08-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母中基因连续无标记整合系统及应用，属于微生物基因工程领域。本发明整合系统基于Cre/loxP位点特异性重组，首先通过第一型载体转化宿主完成第一轮基因无标记整合并引入左臂或右臂突变型lox序列，随后通过交替使用携带有两种特定组合的左臂、右臂突变型lox序列的第二型载体和第三型载体，最终能够高效地在解脂耶氏酵母基因组单个位点处实现目的基因的连续无标记整合。本发明仅需使用单个酵母筛选标记，且能高效地实现大肠杆菌复制起点与筛选标记、Cre基因表达盒、酵母筛选标记及冗余的同源片段等几乎所有非必须DNA片段的剔除，使得多个目的基因表达盒能以特定方式在单个基因位点处实现连续无标记整合。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN105647959A
公开(公告)日：2016-06-08
申请号：CN201610172061.5
申请日：2016-03-24
Applicant: 华中科技大学
CPC classification number: C12N15/815 , C12N15/65 , C12N15/66 , C12N2800/102
Abstract: 本发明公开了一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，首先选取具有目标基因的第一载体和第二载体，然后利用一对同尾酶和一个参考酶对第一载体和第二载体进行酶切，获得具有目标基因的子序列和母序列，获得具有参考片段的目标载体，最后利用参考片段进行快速筛选，获得所述多拷贝表达载体。通过本发明，能快速准确的构建含有特定拷贝数和特定基因的多拷贝数载体，降低了常规构建多拷贝表达载体方法中表达盒连接方向随机、载体直连或者酶切过程不充分等产生假阳性因素的概率，操作简单，效率高。
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公开(公告)号：CN115418371B
公开(公告)日：2024-07-02
申请号：CN202210974824.3
申请日：2022-08-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母中基因连续无标记整合系统及应用，属于微生物基因工程领域。本发明整合系统基于Cre/loxP位点特异性重组，首先通过第一型载体转化宿主完成第一轮基因无标记整合并引入左臂或右臂突变型lox序列，随后通过交替使用携带有两种特定组合的左臂、右臂突变型lox序列的第二型载体和第三型载体，最终能够高效地在解脂耶氏酵母基因组单个位点处实现目的基因的连续无标记整合。本发明仅需使用单个酵母筛选标记，且能高效地实现大肠杆菌复制起点与筛选标记、Cre基因表达盒、酵母筛选标记及冗余的同源片段等几乎所有非必须DNA片段的剔除，使得多个目的基因表达盒能以特定方式在单个基因位点处实现连续无标记整合。
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公开(公告)号：CN117229990A
公开(公告)日：2023-12-15
申请号：CN202311400003.X
申请日：2023-10-26
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程及生物矿化领域，涉及一种高酶活的碱性磷酸酶表面展示工程菌、构建及应用。本发明以大肠杆菌为宿主，利用细胞表面展示系统，将碱性磷酸酶展示在细胞表面，构建了多种可高效去除重金属离子的生物矿化工程菌，并通过对底物的作用，诱导重金属离子的矿化。使用本发明的基因工程菌应用于修复重金属污染修复，在反应2h后，工程菌对Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+等诸多重金属离子均具有良好的吸附及生物矿化效果。因此，本发明的菌株在重金属环境污染治理领域具有较好的工业应用前景。
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公开(公告)号：CN113088533A
公开(公告)日：2021-07-09
申请号：CN202110405939.6
申请日：2021-04-15
Applicant: 华中科技大学
IPC: C12N15/81 , C12N1/19 , C07K14/435 , C12R1/84
Abstract: 本发明公开了表达粘胶蛋白的载体、酵母工程菌和方法，属于蛋白制备技术领域。本发明基于毕赤酵母表达系统，通过提高拷贝数、融合脂肪酶、增加辅助因子等技术手段，并优化了菌液培养基初始pH值、接种量、甲醇添加量、诱导时间、诱导温度等参数，将粘胶蛋白表达量提升到克级，满足了规模化生产应用的需要。进一步地，本发明还公开了用于表达粘胶蛋白的表达载体和酵母工程菌。
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公开(公告)号：CN108004264B
公开(公告)日：2020-09-08
申请号：CN201711340835.1
申请日：2017-12-14
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和HygB抗性基因表达盒。本发明极大地提高了毕赤酵母基因的敲除效率。本发明提供了基因敲除后抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。
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