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公开(公告)号：CN105647959A
公开(公告)日：2016-06-08
申请号：CN201610172061.5
申请日：2016-03-24
Applicant: 华中科技大学
CPC classification number: C12N15/815 , C12N15/65 , C12N15/66 , C12N2800/102
Abstract: 本发明公开了一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，首先选取具有目标基因的第一载体和第二载体，然后利用一对同尾酶和一个参考酶对第一载体和第二载体进行酶切，获得具有目标基因的子序列和母序列，获得具有参考片段的目标载体，最后利用参考片段进行快速筛选，获得所述多拷贝表达载体。通过本发明，能快速准确的构建含有特定拷贝数和特定基因的多拷贝数载体，降低了常规构建多拷贝表达载体方法中表达盒连接方向随机、载体直连或者酶切过程不充分等产生假阳性因素的概率，操作简单，效率高。
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公开(公告)号：CN114958900B
公开(公告)日：2024-04-19
申请号：CN202210528110.X
申请日：2022-05-16
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母无标记整合载体及其应用用，属于微生物基因工程领域。该整合载体包括重组反应区，重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列。本发明仅需单个载体即可高效便捷地实现基因的无标记整合，为在解脂耶氏酵母体内整合多个基因提供了极大的便利。
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公开(公告)号：CN112391402B
公开(公告)日：2023-03-28
申请号：CN202011283106.9
申请日：2020-11-17
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法是通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。共同过表达优选包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。本发明通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。
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公开(公告)号：CN112391402A
公开(公告)日：2021-02-23
申请号：CN202011283106.9
申请日：2020-11-17
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法是通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。共同过表达优选包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。本发明通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。
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公开(公告)号：CN113881677B
公开(公告)日：2024-03-19
申请号：CN202111259893.8
申请日：2021-10-28
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用。本发明通过将不同数量的启动子上游激活序列和解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子串联，构建了一系列解脂耶氏酵母杂合启动子，并将置于报告基因及目的基因上游，控制基因表达以获取特定的最终产物产量，证实了烯醇酶杂合启动子用于解脂耶氏酵母中重组蛋白高效生产的可行性。本发明获得的杂合启动子具有大于或小于解脂耶氏酵母中现有启动子的强度，可适用于异源蛋白高效生产等应用，有助于解决解脂耶氏酵母中的杂合启动子可用性不足的问题，为该宿主的基因工程改造和合成生物学研究与应用提供了新的有效元件。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN113881677A
公开(公告)日：2022-01-04
申请号：CN202111259893.8
申请日：2021-10-28
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种解脂耶氏酵母杂合启动子及其应用。本发明通过将不同数量的启动子上游激活序列和解脂耶氏酵母烯醇酶基因启动子串联，构建了一系列解脂耶氏酵母杂合启动子，并将置于报告基因及目的基因上游，控制基因表达以获取特定的最终产物产量，证实了烯醇酶杂合启动子用于解脂耶氏酵母中重组蛋白高效生产的可行性。本发明获得的杂合启动子具有大于或小于解脂耶氏酵母中现有启动子的强度，可适用于异源蛋白高效生产等应用，有助于解决解脂耶氏酵母中的杂合启动子可用性不足的问题，为该宿主的基因工程改造和合成生物学研究与应用提供了新的有效元件。
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公开(公告)号：CN110408645A
公开(公告)日：2019-11-05
申请号：CN201910747704.8
申请日：2019-08-14
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明涉及一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法，属于基因工程技术领域。本发明所述系统通过质粒1转化解脂耶氏酵母能够引入lox位点，而后通过质粒2和质粒3依次转化，能够实现目的基因任意次数无痕整合到解脂耶氏酵母基因组。本发明仅需一个酵母筛选标记即可实现目的基因任意次数的整合，同时，本发明极大地降低了非目的基因的引入，且每次整合后的基因组均是已知可控的，这有利于解脂耶氏酵母表达系统在食品、医药、农产品加工等领域的应用。
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公开(公告)号：CN105647959B
公开(公告)日：2019-04-12
申请号：CN201610172061.5
申请日：2016-03-24
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，首先选取具有目标基因的第一载体和第二载体，然后利用一对同尾酶和一个参考酶对第一载体和第二载体进行酶切，获得具有目标基因的子序列和母序列，获得具有参考片段的目标载体，最后利用参考片段进行快速筛选，获得所述多拷贝表达载体。通过本发明，能快速准确的构建含有特定拷贝数和特定基因的多拷贝数载体，降低了常规构建多拷贝表达载体方法中表达盒连接方向随机、载体直连或者酶切过程不充分等产生假阳性因素的概率，操作简单，效率高。
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公开(公告)号：CN108004264A
公开(公告)日：2018-05-08
申请号：CN201711340835.1
申请日：2017-12-14
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和HygB抗性基因表达盒。本发明极大地提高了毕赤酵母基因的敲除效率。本发明提供了基因敲除后抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。
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公开(公告)号：CN108004264B
公开(公告)日：2020-09-08
申请号：CN201711340835.1
申请日：2017-12-14
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和HygB抗性基因表达盒。本发明极大地提高了毕赤酵母基因的敲除效率。本发明提供了基因敲除后抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。
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