一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法

    公开(公告)号:CN105567718B

    公开(公告)日:2021-11-09

    申请号:CN201610044291.3

    申请日:2016-01-22

    Applicant: 东华大学

    Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法,将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体;通过PCR扩增,扩增出sgRNA2的表达框,然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入,得到同时表达2个sgRNA的载体;然后通过PCR扩增,扩增出sgRNA3的表达框,然后通过无缝克隆在42230‑sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入,得到同时表达3个sgRNA的载体,依次操作,即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除,解决了现有方法的不足。

    一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法

    公开(公告)号:CN105695581B

    公开(公告)日:2020-03-10

    申请号:CN201610136155.7

    申请日:2016-03-10

    Abstract: 本发明涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法,包括:按照多个基因的相对表达量将相应的PCR引物分为两组,并在组内调整引物浓度比例;构建标准品竞争性模板和待测样品竞争性模板,进行三轮多重竞争性PCR反应;混合第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序,提取数据并分析,即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。本发明基于高速发展的二代测序平台,准确快速定量目标模板和内参照模板,并可以同时对多个样本进行5个目的基因表达差异分析,流程简单易行,价格低廉;当需要分析多样本间多基因表达差异时,不失为一种具有高准确度,通量适中,成本廉价的方法。

    一种mir-505双等位基因敲除的方法

    公开(公告)号:CN104651401B

    公开(公告)日:2019-03-08

    申请号:CN201510098102.6

    申请日:2015-03-05

    Applicant: 东华大学

    Abstract: 本发明涉及一种mir‑505双等位基因敲除的方法,包括:构建两种针对mir‑505基因的打靶载体,在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir‑505基因进行替换敲除,利用G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞,并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir‑505进行敲除,通过荧光筛选得到mir‑505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助,具有良好的应用前景。

    一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法

    公开(公告)号:CN103866009B

    公开(公告)日:2016-08-17

    申请号:CN201410067044.6

    申请日:2014-02-26

    Applicant: 东华大学

    Abstract: 本发明涉及一种改进的茎环引物qRT?PCR检测miRNA的方法,包括:(1)miRNA检测引物的设计:茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列,其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp;qPCR的下游引物针对通用的茎环序列,上游引物针对靶标miRNA的5’端;在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴,以使上下游引物的退火温度相近;(2)将靶标miRNA反转录成cDNA;(3)定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。本发明的方法特异性好、灵敏性高,且只需合成一种下游引物,采用SYBR Green I荧光染料法,大大节约了成本。

    一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法

    公开(公告)号:CN105567718A

    公开(公告)日:2016-05-11

    申请号:CN201610044291.3

    申请日:2016-01-22

    Applicant: 东华大学

    Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法,将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体;通过PCR扩增,扩增出sgRNA2的表达框,然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入,得到同时表达2个sgRNA的载体;然后通过PCR扩增,扩增出sgRNA3的表达框,然后通过无缝克隆在42230-sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入,得到同时表达3个sgRNA的载体,依次操作,即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除,解决了现有方法的不足。

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