公开(公告)号：CN105567718B

公开(公告)日：2021-11-09

申请号：CN201610044291.3

申请日：2016-01-22

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  李文文 ,  王斯佳 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/85

Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230‑sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。

公开(公告)号：CN105567718A

公开(公告)日：2016-05-11

申请号：CN201610044291.3

申请日：2016-01-22

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  李文文 ,  王斯佳 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/85

CPC classification number: C12N15/66 ,  C12N15/85 ,  C12N2800/107 ,  C12N2800/80 ,  C12N2810/10

Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。

公开(公告)号：CN106544322A

公开(公告)日：2017-03-29

申请号：CN201611108955.4

申请日：2016-12-06

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  王斯佳 ,  李文文 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N5/10 ,  C12N15/85 ,  C12N15/65

Abstract: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。

公开(公告)号：CN105177111A

公开(公告)日：2015-12-23

申请号：CN201510587021.2

申请日：2015-09-15

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  林天音 ,  王斯佳 ,  李文文 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12Q1/48

Abstract: 本发明涉及一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，所述表征方法为手工热启动法、热变性时间法、最低循环数法、多重PCR法以及热变性时间与多重PCR法结合。本发明的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性的问题。本发明的热启动Taq酶热启动效率表征方法从多个角度进行验证，及对热启动效率进行半定量的评估，可以保证结果的可靠性。

公开(公告)号：CN106544322B

公开(公告)日：2019-10-08

申请号：CN201611108955.4

申请日：2016-12-06

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  王斯佳 ,  李文文 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N5/10 ,  C12N15/85 ,  C12N15/65

Abstract: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。

公开(公告)号：CN104894071A

公开(公告)日：2015-09-09

申请号：CN201510311719.1

申请日：2015-06-08

Applicant: 东华大学

Inventor： 王斯佳 ,  周宇荀 ,  邓倩云 ,  李晓宁 ,  李文文 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N5/10 ,  C12N15/63

Abstract: 本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。