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公开(公告)号：CN106544322B
公开(公告)日：2019-10-08
申请号：CN201611108955.4
申请日：2016-12-06
Applicant: 东华大学
Abstract: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。
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公开(公告)号：CN104894071A
公开(公告)日：2015-09-09
申请号：CN201510311719.1
申请日：2015-06-08
Applicant: 东华大学
Abstract: 本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN105567718B
公开(公告)日：2021-11-09
申请号：CN201610044291.3
申请日：2016-01-22
Applicant: 东华大学
Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230‑sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。
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公开(公告)号：CN105567718A
公开(公告)日：2016-05-11
申请号：CN201610044291.3
申请日：2016-01-22
Applicant: 东华大学
CPC classification number: C12N15/66 , C12N15/85 , C12N2800/107 , C12N2800/80 , C12N2810/10
Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。
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公开(公告)号：CN106979938A
公开(公告)日：2017-07-25
申请号：CN201710139424.X
申请日：2017-03-09
Applicant: 东华大学
IPC: G01N21/64
CPC classification number: G01N21/6486
Abstract: 本发明提供了一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法，在表达待研究的目的基因的细胞中，敲入红色荧光蛋白基因；在目的基因的阅读框中，敲入绿色荧光蛋白基因；使红、绿色荧光蛋白基因与目的基因同时表达，但彼此独立形成各自的蛋白；所形成的能同时表达红、绿两种荧光蛋白的细胞用于对影响目的基因表达的外部因素进行筛选；用流式细胞仪定量检测细胞的绿色荧光信号的强弱，再用其红色荧光信号值进行均一化，从而对外部因素对目的基因表达的影响进行定量比较，定量检测出影响目的基因表达的外部因素。本方法能同时比较细胞在多种处理条件下，特定基因的表达量差异，在较高通量和较短时间内对基因表达的影响因素进行高灵敏度的筛选。
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公开(公告)号：CN103937826A
公开(公告)日：2014-07-23
申请号：CN201410136599.1
申请日：2014-04-04
Applicant: 东华大学
IPC: C12N15/66
Abstract: 本发明涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括：用PCR方法获得目的基因，将GFAP启动子从pAAV-GFAP-hchR2-mcherry-WPRE载体上用合适的限制性内切酶切下，与目的基因连接克隆到pUC19载体上，然后通过合适的酶切位点将GFAP-EGFP-mir-505片段从pUC载体上切下，克隆到PB载体上，获得载体。本发明可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位。
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公开(公告)号：CN106544322A
公开(公告)日：2017-03-29
申请号：CN201611108955.4
申请日：2016-12-06
Applicant: 东华大学
Abstract: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9‑dtomato；构建绿色荧光蛋白打靶系统；EGFP受Kiss1表达调控元件控制的Cas9‑GT1‑7‑Kiss1‑2A‑EGFP细胞的构建；插入稳定表达的红色荧光背景，即得。本发明实现对研究对象对Kiss1作用效应的量化评估。
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公开(公告)号：CN103937826B
公开(公告)日：2016-04-06
申请号：CN201410136599.1
申请日：2014-04-04
Applicant: 东华大学
IPC: C12N15/66
Abstract: 本发明涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括：用PCR方法获得目的基因，将GFAP启动子从pAAV-GFAP-hchR2-mcherry-WPRE载体上用合适的限制性内切酶切下，与目的基因连接克隆到pUC19载体上，然后通过合适的酶切位点将GFAP-EGFP-mir-505片段从pUC载体上切下，克隆到PB载体上，获得载体。本发明可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位。
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