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公开(公告)号：CN105821116A
公开(公告)日：2016-08-03
申请号：CN201610237236.6
申请日：2016-04-15
Applicant: 扬州大学
CPC classification number: C12Q1/66 , C12Q1/44 , G01N33/68 , G01N2333/47
Abstract: 本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)目的基因克隆；(2)gRNA设计及合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测。本发明的优越性在于：1、实验周期较短速；2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3、运用该方法构建的活性载体，毒副作用小，可用于转基因动物的制备与生产；4、该方法非特异剪切较少，显著提高了基因靶向敲除效率高。5、该方法适用性高。
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公开(公告)号：CN104762265A
公开(公告)日：2015-07-08
申请号：CN201510195770.0
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
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公开(公告)号：CN104745527A
公开(公告)日：2015-07-01
申请号：CN201510193606.6
申请日：2015-04-22
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/073
Abstract: 本发明公开了一种新的快速鸡胚盘的分离方法：首先将鸡胚钝端向上握在手中，用镊子尖头轻轻在受精蛋中部钻出一个小孔后，将镊子一端插入小孔，沿着赤道线方向，依次用镊子夹碎蛋壳，延赤道线分离蛋壳一圈后，轻轻的剥离钝端蛋壳，在此过程中应尽量保持鸡胚水平，防止卵黄随蛋清流出；剥离蛋壳后，用镊子将蛋清从卵黄中分离；使用镊子的侧面拨动卵黄，寻找胚盘；找到胚盘后，尽量将胚盘拨到正中央，用剪刀沿胚盘四周呈正方形剪开，此时，使用镊子夹住将含有胚盘的正方形卵黄膜一角，沿水平方向轻轻拉出来，将此卵黄膜放入37℃的PBS的培养皿中，轻轻晃动培养皿,使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来，从而获得了完整的胚盘。
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公开(公告)号：CN113265449A
公开(公告)日：2021-08-17
申请号：CN202110651600.4
申请日：2021-06-11
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/6858 , C12Q1/66
Abstract: 本发明涉及一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法，包括以下步骤：确定DNA甲基化对目的基因的调控、确定组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控、确定DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3对目的基因的表达调控；确定何种表观遗传修饰对目的基因起主要调控作用。通过本发明，本方法简单可行，具有可行性，操作简便，研究思路清晰可靠，具有广泛应用性，因DNA甲基化和组蛋白甲基化具有高度保守性，因此在不同物种或不同生物学过程中均能使用该方法研究DNA甲基化和组蛋白甲基化对基因表达的调控模式。
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公开(公告)号：CN111778289A
公开(公告)日：2020-10-16
申请号：CN202010734335.1
申请日：2020-07-27
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N15/90 , C12N15/867
Abstract: 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。本发明通过基因编辑技术沉默基因的表达为基因功能的研究提供了重要的技术手段，RISPR-Cas9系统属于基因编辑技术中的一种，具有敲除效率高、操作简单、成本低等优点。为此，本发明利用RISPR-Cas9技术构建Bmp4敲除载体，不仅能够从基因组上抑制Bmp4的表达，为更准确地研究Bmp4基因在鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）形成过程中的功能提供实验素材，而且也有利于为将来构建基因敲除鸡模型奠定实验基础。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN111690594A
公开(公告)日：2020-09-22
申请号：CN202010685364.3
申请日：2020-07-16
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/073 , C12N5/077 , C12Q1/6888 , C12Q1/6879 , C12Q1/06 , G01N33/68
Abstract: 本发明涉及一种鸡两性CEF的体外分离和培养方法，包括以下步骤：（1）对孵化9-10日龄的早期胚蛋进行消毒，取出胚胎后剥离出皮肤，同时采取胚胎血液进行性别鉴定，取出不同性别的皮肤组织；（2）将不同性别的皮肤组织进行消化和过滤，计数后进行培养；（3）观察不同性别皮肤组织的CEF细胞，并采取样本进行鉴定。本发明与提供了一种鸡两性CEF的体外分离和培养方法，可以准确的分离鸡两性CEF，可用于禽类性别决定和分化模型的建立，单一性别的CEF能够提高其作为疾病模型的相关研究中的准确性和可信度。本发明中的性别鉴定和两性CEF的分离培养方法也可以应用于其他禽类研究中，具有很好的推广应用价值。
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公开(公告)号：CN111676299A
公开(公告)日：2020-09-18
申请号：CN202010749121.1
申请日：2020-07-30
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/6888 , C12Q1/6869
Abstract: 本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，包括以下步骤：（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；（3）单细胞测序仪器进行上机建库；（4）对测序数据进行分析；（5）细胞亚群的鉴定。通过本发明，可以准确的鉴定胚盘中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。
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公开(公告)号：CN111650327A
公开(公告)日：2020-09-11
申请号：CN202010685235.4
申请日：2020-07-16
Applicant: 扬州大学
IPC: G01N30/88
Abstract: 本发明涉及一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，包括以下步骤：（1）鸡不同细胞或组织的组织或细胞蛋白提取；（2）对步骤（1）中得到的不同组的细胞或组织蛋白进行胰酶酶解；（3）酶解后的细胞或组织蛋白进行液相色谱-质谱联用分析；（4）对分析结果进行数据库搜库和注释分析。通过本发明，本发明的优越性在于：1、本发明能够较快的获得不同组织和细胞之间的差异表达蛋白。2、方法简单可行，可重复性强，结果准确。3、该方法适用于其他物种。
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公开(公告)号：CN105838667B
公开(公告)日：2019-10-18
申请号：CN201610252413.8
申请日：2016-04-21
Applicant: 扬州大学
IPC: C12N5/0735 , C12N5/073 , C12Q1/6851 , G01N33/68
Abstract: 本发明公开了一种TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109761，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109761+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：LY2109761，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。
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公开(公告)号：CN108949921A
公开(公告)日：2018-12-07
申请号：CN201810916667.4
申请日：2018-08-13
Applicant: 扬州大学
IPC: C12Q1/6851 , G01N33/68
CPC classification number: C12Q1/6851 , G01N33/68 , C12Q2521/107 , C12Q2563/107 , C12Q2531/113
Abstract: 本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，涉及一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，包括如下步骤：Stra8基因3’UTR序列的获得；Stra8基因靶向miRNA预测；最佳miRNA筛选；验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；体内验证miRNA对公鸡生精的影响。相对于现有技术，本发明本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证Stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对Stra8基因进行抑制，以便更好在SSC中进行基因功能验证。
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