公开(公告)号：CN106591364B

公开(公告)日：2018-12-25

申请号：CN201611001075.7

申请日：2016-11-14

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张涌 ,  高元鹏 ,  陈琳琳 ,  刘鑫 ,  吴海波 ,  袁梦珂

IPC: C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。

公开(公告)号：CN106591364A

公开(公告)日：2017-04-26

申请号：CN201611001075.7

申请日：2016-11-14

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 张涌 ,  高元鹏 ,  陈琳琳 ,  刘鑫 ,  吴海波 ,  袁梦珂

IPC: C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

CPC classification number: C12N15/85 ,  A01K67/0276 ,  A01K2227/101 ,  A01K2267/02 ,  C07K14/47 ,  C12N5/0656 ,  C12N2800/107 ,  C12N2800/80

Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。