公开(公告)号：CN102517271B

公开(公告)日：2013-04-03

申请号：CN201110415465.X

申请日：2011-12-13

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘杰 ,  刘昌春 ,  陈杰 ,  沈忠耀

IPC: C12N9/88 ,  C12N15/60 ,  C12N15/63 ,  C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/19 ,  C12R1/365 ,  C12R1/15 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了属于酶工程和工业微生物技术领域的一种耐热和超声耐受性突变腈水合酶。该突变腈水合酶的获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换和添加；所述置换的残基对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的残基位于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的末端残基之后，添加个数为1-2个。本发明突变腈水合酶的抗逆性好，耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升。

公开(公告)号：CN101663389B

公开(公告)日：2011-12-28

申请号：CN200880000969.1

申请日：2008-03-24

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  马玉超 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/78 ,  C12P13/02 ,  C12R1/38 ,  C12R1/365 ,  C12R1/15 ,  C12R1/125

CPC classification number: C12N9/88 ,  C12P13/02 ,  C12R1/01 ,  C12Y402/01084

Abstract: 本发明公开了一种产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用，本发明产腈水合酶工程菌就是敲除或抑制了产腈水合酶原始菌株中的酰胺酶基因后得到的产腈水合酶突变菌株。该工程菌的构建方法是利用携带酰胺酶基因片断的重组自杀质粒，与野生菌的酰胺酶基因进行同源重组，通过自杀质粒大片断的插入阻断野生菌中酰胺酶基因的表达。本发明的产腈水合酶工程菌与相应的野生菌相比，其细胞生长和腈水合酶表达均有所提高；并且在催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺的过程中，产物丙烯酰胺的生成量显著提高，副产物丙烯酸的生成量大大降低。产品质量高，精制成本低，在微生物法生产丙烯酰胺过程中具有广泛的应用前景。

公开(公告)号：CN102517271A

公开(公告)日：2012-06-27

申请号：CN201110415465.X

申请日：2011-12-13

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘杰 ,  刘昌春 ,  陈杰 ,  沈忠耀

IPC: C12N9/88 ,  C12N15/60 ,  C12N15/63 ,  C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/19 ,  C12R1/365 ,  C12R1/15 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了属于酶工程和工业微生物技术领域的一种耐热和超声耐受性突变腈水合酶。该突变腈水合酶的获得方法是对具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸残基的至少一个残基进行置换和添加；所述置换的残基对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的残基位于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的末端残基之后，添加个数为1-2个。本发明突变腈水合酶的抗逆性好，耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升。

公开(公告)号：CN101709286B

公开(公告)日：2012-05-23

申请号：CN200910210177.3

申请日：2007-09-20

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌株紫红红球菌(R.rhodochrous)TH-2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用该基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产所得丙烯酰胺质量高。

公开(公告)号：CN101186911B

公开(公告)日：2010-06-02

申请号：CN200710122047.5

申请日：2007-09-20

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N15/09 ,  C12N15/52 ,  C12N9/00 ,  C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/365

Abstract: 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌-大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH-1和紫红红球菌TH-2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。

公开(公告)号：CN101709286A

公开(公告)日：2010-05-19

申请号：CN200910210177.3

申请日：2007-09-20

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌株紫红红球菌(R.rhodochrous)TH-2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用该基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产所得丙烯酰胺质量高。

公开(公告)号：CN101663389A

公开(公告)日：2010-03-03

申请号：CN200880000969.1

申请日：2008-03-24

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  马玉超 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/78 ,  C12P13/02 ,  C12R1/125 ,  C12R1/15 ,  C12R1/365 ,  C12R1/38

CPC classification number: C12N9/88 ,  C12P13/02 ,  C12R1/01 ,  C12Y402/01084

Abstract: 本发明公开了一种产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用，本发明产腈水合酶工程菌就是敲除或抑制了产腈水合酶原始菌株中的酰胺酶基因后得到的产腈水合酶突变菌株。该工程菌的构建方法是利用携带酰胺酶基因片断的重组自杀质粒，与野生菌的酰胺酶基因进行同源重组，通过自杀质粒大片断的插入阻断野生菌中酰胺酶基因的表达。本发明的产腈水合酶工程菌与相应的野生菌相比，其细胞生长和腈水合酶表达均有所提高；并且在催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺的过程中，产物丙烯酰胺的生成量显著提高，副产物丙烯酸的生成量大大降低。产品质量高，精制成本低，在微生物法生产丙烯酰胺过程中具有广泛的应用前景。

公开(公告)号：CN101186911A

公开(公告)日：2008-05-28

申请号：CN200710122047.5

申请日：2007-09-20

Applicant: 清华大学

Inventor： 于慧敏 ,  刘昌春 ,  沈忠耀

IPC: C12N15/09 ,  C12N15/52 ,  C12N9/00 ,  C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/365

Abstract: 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌－大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH－1和紫红红球菌TH－2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。