公开(公告)号：CN109825522A

公开(公告)日：2019-05-31

申请号：CN201910201916.6

申请日：2019-03-18

Applicant: 海南大学

Inventor： 郑继平 ,  郭桂英 ,  曾纪锋 ,  杨诺 ,  周楚新 ,  李迁

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/90

Abstract: 本发明公开一种基于CRISPR/Cas9和λ-Red的无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于：1.pKS9分子量11,681kb，为温敏性质粒。含有基因：受四环素诱导的cas9和recX基因；受阿拉伯糖诱导的λ-Red完整αβγ重组酶基因；抗性基因ampr。2.pCSK分子量2,914kb，含有两个用于特异性识别基因组的sgRNA插入位点；两个受鼠李糖诱导、用于自身质粒消除的间隔区gRNA序列；抗性基因kanr。3.在同源臂27bp时，同时双点突变效率皆在92%以上；在同源臂40bp时，同时双基因的1kb替换效率在60%以上，当大片段基因替换和点突变同时进行时，各自的编辑效率不受影响。

公开(公告)号：CN109825522B

公开(公告)日：2022-09-23

申请号：CN201910201916.6

申请日：2019-03-18

Applicant: 海南大学

Inventor： 郑继平 ,  郭桂英 ,  曾纪锋 ,  杨诺 ,  周楚新 ,  李迁

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/90

Abstract: 本发明公开一种基于CRISPR/Cas9和λ‑Red的无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于：1.pKS9分子量11,681kb，为温敏性质粒。含有基因：受四环素诱导的cas9和recX基因；受阿拉伯糖诱导的λ‑Red完整αβγ重组酶基因；抗性基因ampr。2.pCSK分子量2,914 kb，含有两个用于特异性识别基因组的sgRNA插入位点；两个受鼠李糖诱导、用于自身质粒消除的间隔区gRNA序列；抗性基因kanr。3.在同源臂27bp时，同时双点突变效率皆在92%以上；在同源臂40bp时，同时双基因的1kb替换效率在60%以上，当大片段基因替换和点突变同时进行时，各自的编辑效率不受影响。

公开(公告)号：CN110423827A

公开(公告)日：2019-11-08

申请号：CN201910300214.3

申请日：2019-04-15

Applicant: 海南大学

Inventor： 郑继平 ,  郭桂英 ,  曾纪锋 ,  杨诺 ,  李迁 ,  周楚新

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6844 ,  C12Q1/14

Abstract: 本发明公开一种以肽聚糖水解酶pcsB基因为靶序列的环介导等温扩增快速检测无乳链球菌的方法，所述引物含SEQID.NO.1-2的内引物，SEQID.NO.3-4的外引物和SEQID.NO.5的环引物。其特征在于：1）64°C,1小时LAMP反应，通过实时浊度仪可有效检测无乳链球菌的最低基因组模板量为1 pg，灵敏度是普通PCR电泳分析和荧光PCR的100倍。2）以SYBR Green I为显色试剂，LAMP反应1-3小时可对1 ng模板的无乳链球菌进行准确检测。

公开(公告)号：CN117535214B

公开(公告)日：2025-05-23

申请号：CN202311310100.X

申请日：2023-10-10

Applicant: 海南大学

Inventor： 杨诺 ,  郑继平 ,  曾纪锋 ,  李雪松 ,  郭桂英 ,  范丽霞 ,  李迁

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/74 ,  C12N15/64 ,  C12N15/31 ,  A61K39/02 ,  A61P31/04 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了达卡气单胞菌ugd及phoB基因单双缺失突变株、回补株及其构建方法和应用。本发明通过无痕敲除的方法成功构建了达卡气单胞菌Δugd基因单缺失突变株以及达卡气单胞菌ΔugdΔphoB基因双缺失突变株，并通过无缝克隆方式成功构建回补株ΔugdΔphoB+CphoB。研究发现，相比较野生株，Δugd突变株(LD50)毒力下降了73倍(减少17.4倍)，ΔugdΔphoB突变株(LD50)毒力下降了7.45倍。Δugd突变株的免疫保护率为60％，ΔugdΔphoB双突变株的免疫保护率为36.7％。可以作为候选弱毒疫苗来抵抗野生型达卡气单胞菌C160501菌株的感染。本发明的提出为达卡气单胞菌病减毒活疫苗的研究提供了技术手段。

公开(公告)号：CN117535214A

公开(公告)日：2024-02-09

申请号：CN202311310100.X

申请日：2023-10-10

Applicant: 海南大学

Inventor： 杨诺 ,  郑继平 ,  曾纪锋 ,  李雪松 ,  郭桂英 ,  范丽霞 ,  李迁

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/74 ,  C12N15/64 ,  C12N15/31 ,  A61K39/02 ,  A61P31/04 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了达卡气单胞菌ugd及phoB基因单双缺失突变株、回补株及其构建方法和应用。本发明通过无痕敲除的方法成功构建了达卡气单胞菌Δugd基因单缺失突变株以及达卡气单胞菌ΔugdΔphoB基因双缺失突变株，并通过无缝克隆方式成功构建回补株ΔugdΔphoB+CphoB。研究发现，相比较野生株，Δugd突变株(LD50)毒力下降了73倍(减少17.4倍)，ΔugdΔphoB突变株(LD50)毒力下降了7.45倍。Δugd突变株的免疫保护率为60％，ΔugdΔphoB双突变株的免疫保护率为36.7％。可以作为候选弱毒疫苗来抵抗野生型达卡气单胞菌C160501菌株的感染。本发明的提出为达卡气单胞菌病减毒活疫苗的研究提供了技术手段。

公开(公告)号：CN110423827B

公开(公告)日：2022-07-19

申请号：CN201910300214.3

申请日：2019-04-15

Applicant: 海南大学

Inventor： 郑继平 ,  郭桂英 ,  曾纪锋 ,  杨诺 ,  李迁 ,  周楚新

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6844 ,  C12Q1/14

Abstract: 本发明公开一种以肽聚糖水解酶pcsB基因为靶序列的环介导等温扩增快速检测无乳链球菌的方法，所述引物含SEQID.NO.1‑2的内引物，SEQID.NO.3‑4的外引物和SEQID.NO.5的环引物。其特征在于：1）64°C,1小时LAMP反应，通过实时浊度仪可有效检测无乳链球菌的最低基因组模板量为1 pg，灵敏度是普通PCR电泳分析和荧光PCR的100倍。2）以SYBR Green I为显色试剂，LAMP反应1‑3小时可对1 ng模板的无乳链球菌进行准确检测。