公开(公告)号：CN114480467A

公开(公告)日：2022-05-13

申请号：CN202210184437.X

申请日：2022-02-24

Applicant: 江南大学

Inventor： 史锋 ,  陈睿 ,  李永富

IPC: C12N15/77 ,  C12N15/90 ,  C12N15/113 ,  C12N9/22 ,  C12N15/54 ,  C12N1/21 ,  C12R1/15

Abstract: 本发明公开了一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR‑cpf1筛选工具，属于基因工程领域。本发明通过对现有基因编辑技术的改进及组合，提供了一种提高基于自杀质粒介导的同源重组及sacB系统二轮交换时的筛选效率的筛选工具，基于CRISPR/Cpf1机理及谷氨酸棒杆菌不存在非同源修复机制给予的致死性，创造性地开发了一种反向筛选工具，并无需再做改造或更换sgRNA就能直接用于筛选二轮交换菌株，解决了sacB系统二轮交换低效的问题，并具有普适性。同时降低了假阳性的概率、显著提升了筛选效果。在棒状杆菌的基因编辑及进一步利用中有广阔的应用前景。

公开(公告)号：CN116732082A

公开(公告)日：2023-09-12

申请号：CN202310699287.0

申请日：2023-06-14

Applicant: 江南大学

Inventor： 史锋 ,  陈睿 ,  李永富

IPC: C12N15/77 ,  C12N15/90 ,  C12N15/11 ,  C12N15/31 ,  C12N1/21 ,  C12P13/04 ,  C12R1/15

Abstract: 本发明公开了一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法，具体涉及一种在谷氨酸棒杆菌等棒杆菌中进行基因多拷贝整合的方法，属于基因工程领域。本发明提供的多拷贝整合系统是基于IScg1基因在谷氨酸棒杆菌有8个拷贝，通过不断进行整合质粒的转化及逐步提高的筛选压力将多个目的/外源基因表达框整合在染色体上，最后经过10轮进化，成功构建多拷贝整合目的基因的重组菌株。本发明提供的整合质粒以pBlueScript IISK(‑)为骨架，携带IScg1的上下游同源臂、筛选标记基因、目的基因表达框。其中，所述筛选标记表达盒包括内源性启动子和筛选标记基因，通过弱启动子降低菌株对抗生素的耐受性，从而提高目的菌株的筛选效率，为谷氨酸棒杆菌基因多拷贝整合提供了新的思路。

公开(公告)号：CN114480467B

公开(公告)日：2023-08-25

申请号：CN202210184437.X

申请日：2022-02-24

Applicant: 江南大学

Inventor： 史锋 ,  陈睿 ,  李永富

IPC: C12N15/77 ,  C12N15/90 ,  C12N15/113 ,  C12N9/22 ,  C12N15/54 ,  C12N1/21 ,  C12R1/15

Abstract: 本发明公开了一种在棒状杆菌中辅助sacB基因编辑系统的CRISPR‑cpf1筛选工具，属于基因工程领域。本发明通过对现有基因编辑技术的改进及组合，提供了一种提高基于自杀质粒介导的同源重组及sacB系统二轮交换时的筛选效率的筛选工具，基于CRISPR/Cpf1机理及谷氨酸棒杆菌不存在非同源修复机制给予的致死性，创造性地开发了一种反向筛选工具，并无需再做改造或更换sgRNA就能直接用于筛选二轮交换菌株，解决了sacB系统二轮交换低效的问题，并具有普适性。同时降低了假阳性的概率、显著提升了筛选效果。在棒状杆菌的基因编辑及进一步利用中有广阔的应用前景。