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公开(公告)号：CN111235135A
公开(公告)日：2020-06-05
申请号：CN202010180787.X
申请日：2020-03-16
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第138位、第691位、第692位和第694位的氨基酸进行突变，得到了四个热稳定性提高且催化效率未改变的普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M及T694F。在70℃下，其半衰期可分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍。其中，G692M突变体的热稳定性得到最明显的改善，其在60、65℃下的半衰期甚至可分别达到58h、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍。本发明中热稳定性提高的中性普鲁兰酶突变体将更适合于工业应用。
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公开(公告)号：CN102676480B
公开(公告)日：2013-02-27
申请号：CN201210187066.7
申请日：2012-06-08
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明将黑座克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola）CCTCC M2012108普鲁兰酶编码基因插入表达载体pET28a(+)中构建重组质粒，并转化大肠杆菌获得含有目的普鲁兰酶基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自诱导培养基，并采用先37℃培养2~4小时后25℃继续培养48~72小时的双温度调控方式，将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA进行培养和发酵产酶。采用优化后的自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70U/mL。本发明为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。
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公开(公告)号：CN101857887B
公开(公告)日：2012-11-14
申请号：CN201010205573.X
申请日：2010-06-13
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明在水相或有机/水双相反应体系中，利用重组菌无细胞提取物催化不同底物芳基酮，获得光学纯芳基醇，产物光学纯度为90％～100％e.e.，产率为50％～90％。通过添加10～20g/L辅助底物，初始辅酶0.005～0.2mM NADP+，实现反应必需辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为936～3604。反应时间由全细胞催化体系的12～48h缩短至2～12h。与常规纯酶或全细胞催化方式不同，该无细胞系统不需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，同时缩短反应时间，而且该系统还适用于其他的醇脱氢酶和羰基还原酶，是一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的生物催化系统。
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公开(公告)号：CN101230363A
公开(公告)日：2008-07-30
申请号：CN200710135444.6
申请日：2007-11-11
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种利用重组菌株不对称转化制备(R)－苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明将(R)－专一性醇脱氢酶基因rcr插入载体pET21c中构建重组质粒pET－RCR，转化入大肠杆菌构建重组菌株E.coli BL21/pET－RCR。该重组菌株具有催化不对称转化2－羟基苯乙酮为(R)－苯基乙二醇的能力。通过优化反应条件，在pH8.0的Tris－HCl缓冲液中添加2.5％～10％异丙醇作为辅助底物，利用0.1～0.4g/mL重组细胞对浓度为0.5～5g/L底物2－羟基苯乙酮催化转化48h，最终得到光学纯度为80～100％e.e.，产率为70～100％的产物(R)－苯基乙二醇。本发明不仅为制备(R)－苯基乙二醇提供了有效途径，对于今后手性转化用生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
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公开(公告)号：CN111235135B
公开(公告)日：2021-11-02
申请号：CN202010180787.X
申请日：2020-03-16
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种中性普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第138位、第691位、第692位和第694位的氨基酸进行突变，得到了四个热稳定性提高且催化效率未改变的普鲁兰酶突变体D138F、C691R、G692M及T694F。在70℃下，其半衰期可分别是野生型的1.35、1.58、2.07及1.64倍。其中，G692M突变体的热稳定性得到最明显的改善，其在60、65℃下的半衰期甚至可分别达到58h、19h，分别是野生型的2.5、1.8倍。本发明中热稳定性提高的中性普鲁兰酶突变体将更适合于工业应用。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN113265386A
公开(公告)日：2021-08-17
申请号：CN202110527128.3
申请日：2021-05-14
Applicant: 宿迁市江南大学产业技术研究院
Abstract: 本发明公开了一种耐热型中性普鲁兰酶的突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明分别通过对普鲁兰酶的第73位、第135/314位、第135/314/126位和第135/314/126/72位的氨基酸进行突变，得到了4个热稳定性提高、催化效率不变或提高的普鲁兰酶突变体。在70℃下，其半衰期分别是野生型的2.6、1.9、3.3及3.1倍；Tm值分别提高了7.0、6.5、6.7、6.9℃。通过在耐高温中性普鲁兰酶突变体的N末端融合OptPelB使普鲁兰酶的胞外酶活达到9.7U·/mL，是野生型的的4.9倍。本发明中能够分泌表达的耐热中性普鲁兰酶突变体具有淀粉原料高值化利用的应用潜力。
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公开(公告)号：CN104152506A
公开(公告)日：2014-11-19
申请号：CN201410388122.2
申请日：2014-08-08
Applicant: 江南大学
Abstract: 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（(S)-DHTP）的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明是在重组菌粗酶体系中添加辅助底物和初始量辅酶NADP+促进体系中的辅酶NADPH的再生循环，反应底物为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DTKP），重组菌为表达醛酮还原酶基因的E.coliBL21(DE3)(pETCPAR4)，醛酮还原酶基因cpar4来自于近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）CCTCCNO：M203011，该基因编码醛酮还原酶CPAR4，催化不对称还原DKTP为(S)-DHTP。本发明利用该无细胞系统催化反应，无需在反应体系中额外添加辅酶再生所需的耦联酶，提高了酶与底物直接作用的效率，缩短反应时间，获得较好的转化效果。
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公开(公告)号：CN103525852A
公开(公告)日：2014-01-22
申请号：CN201310505719.6
申请日：2013-10-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种基于自诱导培养和有色底物相结合的高通量筛选重组菌的方法，属于高通量筛选表达目的基因重组大肠杆菌的技术领域。本发明对该高通量筛选方法的灵敏性、高效性和可靠性进行了验证。设计了一种可视化的高通量筛选表达普鲁兰酶重组菌的红色固体平板培养基，通过该筛选平板，获得稳定表达普鲁兰酶的重组菌株，其在液体LB培养基中能得到11U/mL的胞外重组普鲁兰酶酶活，SDS-PAGE分析发现目的蛋白表达正常。通过菌落PCR和质粒双酶切方法，验证了筛选获得重组菌均含有正确的重组质粒。本发明能够直观准确的从退化菌种中筛选到表达稳定的重组菌株，具有可视化、直观、方便、高效等优点，为保持重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的稳定性提供了有效策略。
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公开(公告)号：CN102676480A
公开(公告)日：2012-09-19
申请号：CN201210187066.7
申请日：2012-06-08
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明将黑座克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola）CCTCC NO：M2012108普鲁兰酶编码基因插入表达载体pET28a(+)中构建重组质粒，并转化大肠杆菌获得含有目的普鲁兰酶基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自诱导培养基，并采用先37℃培养2~4小时后25℃继续培养48~72小时的双温度调控方式，将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA进行培养和发酵产酶。采用优化后的自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到60~70U/mL。本发明为重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于今后开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。
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公开(公告)号：CN101230363B
公开(公告)日：2012-04-18
申请号：CN200710135444.6
申请日：2007-11-11
Applicant: 江南大学
Abstract: 一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明将(R)-专一性醇脱氢酶基因rcr插入载体pET21c中构建重组质粒pET-RCR，转化入大肠杆菌构建重组菌株E.coli BL21/pET-RCR。该重组菌株具有催化不对称转化2-羟基苯乙酮为(R)-苯基乙二醇的能力。通过优化反应条件，在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加2.5％～10％异丙醇作为辅助底物，利用0.1～0.4g/mL重组细胞对浓度为0.5～5g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终得到光学纯度为80～100％e.e.，产率为70～100％的产物(R)-苯基乙二醇。本发明不仅为制备(R)-苯基乙二醇提供了有效途径，对于今后手性转化用生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
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