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公开(公告)号：CN107881159B
公开(公告)日：2020-10-09
申请号：CN201711352455.X
申请日：2017-12-15
Applicant: 江南大学
IPC: C12N9/06 , C12N15/53 , C12N15/70 , C12N1/21 , C12P7/40 , C12P13/04 , C12P35/02 , C12Q1/26 , C12R1/19
Abstract: 本发明公开了一种提高D‑氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，在甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸。本发明得到的突变体获得的体积酶活比野生型提高3.4倍。同时突变体经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L‑1·h‑1，为圆冬红酵母在大肠杆菌中表达获得的最高酶活，加强了该酶的工业应用潜力。
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公开(公告)号：CN106119272B
公开(公告)日：2020-03-24
申请号：CN201610574812.6
申请日：2016-07-20
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明是一种将葡萄糖脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达，利用重组大肠杆菌酶法和全细胞法联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。本发明在于：将葡萄糖脱氢酶基因和L‑亮氨酸脱氢酶基因构建重组单独和共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。利用重组菌酶法和全细胞法转化可以促进辅因子在转化体系中的循环，仅需添加少量外源辅因子或不添加外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用底物苯甲酰甲酸及葡萄糖联产高附加值的L‑苯苷氨酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中转化2‑4h，该方法所得的L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸产量分别可达58.8g/L及75.6g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
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公开(公告)号：CN106047829B
公开(公告)日：2019-11-22
申请号：CN201610453958.5
申请日：2016-06-22
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明是一种新型来源的过氧化氢酶及其重组工程菌的构建。本发明在于：首次根据短小芽孢杆菌的过氧化氢酶基因设计引物并构建了重组表达载体。将载体转化至基因工程菌大肠杆菌及枯草芽孢杆菌进行异源表达。利用发酵培养基对重组工程菌进行5L发酵罐发酵培养，其中重组大肠杆菌的过氧化氢酶主要在胞内表达，酶活为6645U/mL，重组B.subtilis 168的过氧化氢酶总酶活达到23263U/mL，胞外酶活为15368U/mL，而在B.subtilis WB600的过氧化氢酶总酶活高达26635U/mL，胞外酶活为20128U/mL，利用B.subtilis WB600为宿主更有利于胞外合成过氧化氢酶，具有重要的工业应用价值。这是目前报道的利用微生物生产过氧化氢酶的最高产量，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
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公开(公告)号：CN106520651A
公开(公告)日：2017-03-22
申请号：CN201610979842.5
申请日：2016-11-08
Applicant: 江南大学
CPC classification number: C12N9/0024 , C12N9/0008 , C12N9/0016 , C12P13/08 , C12Y102/01002 , C12Y104/01009 , C12Y104/03003
Abstract: 通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶成功在C.glutamicum ATCC13032中表达。通过构建重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，将来源于Bacillus cereus和Candida boidinii的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶成功在E.coli BL21中表达。以上述三株工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以混合型DL-正缬氨酸作为底物，同时确定了最佳的反应温度为30℃和pH为7.5。在最佳的转化条件下进行酶法动力学拆分生产L-正缬氨酸。25h后转化液中的L-正缬氨酸的含量为80.09g/L，L-正缬氨酸产率为98.3％。本发明方法生产L-正缬氨酸具有效率高，绿色环保，产品纯度高等优点。
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公开(公告)号：CN106119272A
公开(公告)日：2016-11-16
申请号：CN201610574812.6
申请日：2016-07-20
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明是一种将葡萄糖脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达，利用重组大肠杆菌酶法和全细胞法联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。本发明在于：将葡萄糖脱氢酶基因和L‑亮氨酸脱氢酶基因构建重组单独和共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。利用重组菌酶法和全细胞法转化可以促进辅因子在转化体系中的循环，仅需添加少量外源辅因子或不添加外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用底物苯甲酰甲酸及葡萄糖联产高附加值的L‑苯苷氨酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中转化2‑4h，该方法所得的L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸产量分别可达58.8g/L及75.6g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN105238807A
公开(公告)日：2016-01-13
申请号：CN201510817220.8
申请日：2015-11-23
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明是一种串联氨基酸脱氢酶及密码子优化的甲酸脱氢酶重组大肠杆菌制备α-氨基丁酸的方法。首先，按照大肠杆菌的密码子偏好对博伊丁假丝酵母菌甲酸脱氢酶基因序列进行密码子优化。对甲酸脱氢酶密码子优化后可以显著提高其在大肠杆菌中的表达量，增加α-氨基丁酸的产量，同时共表达甲酸脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶于大肠杆菌中可以促进辅因子在菌体胞内的循环，可以不需要添加任何外源辅因子，另外利用全细胞转化大宗化学品L-苏氨酸生产α-氨基丁酸过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中该方法所得的α-氨基丁酸产量可达81.5g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
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公开(公告)号：CN108559735A
公开(公告)日：2018-09-21
申请号：CN201810443305.8
申请日：2018-05-10
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明提供一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.8三个亮氨酸脱氢酶突变体，以及上述突变体或产生突变体的基因工程菌在氨化还原α-酮酸制备光学纯手性L-α-氨基酸中的应用。本发明在于：所述亮氨酸脱氢酶突变体或含有突变体基因工程菌氨化还原制备L-α-氨基酸具有高催化活性及稳定性，能够合成高光学纯度L-α-氨基酸(ee>99％)，如突变体酶催化L-苯甘氨酸的转化速率提高了2.62倍，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
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公开(公告)号：CN108103038A
公开(公告)日：2018-06-01
申请号：CN201711352466.8
申请日：2017-12-15
Applicant: 江南大学
CPC classification number: C12N9/0016 , C12N9/0008 , C12P13/04 , C12Y102/01002 , C12Y104/01009
Abstract: 本发明公开了一种高效合成L‑苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。本发明首先实现了来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达，并通过定点突变得到还原特性显著提高的突变体N71S，并将该突变酶与甲酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中共表达，形成胞内原位辅因子NADH循环体系，通过启动子和RBS序列优化控制甲酸脱氢酶突变体的表达量，成功构建了重组大肠杆菌单细胞工厂，并利用单细胞工厂进行全细胞转化制备L‑苯苷氨酸，该方法转化过程简单快捷，成本低廉，没有副产物，利于分离纯化，在5L发酵罐中转化4h，L‑苯甘氨酸产量可达105.7g/l，转化率为93.3％，L‑苯苷氨酸的时空产率为26.3g/L·h，为L‑苯苷氨酸的工业化生产提供了一种实际有效的策略。
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公开(公告)号：CN107881159A
公开(公告)日：2018-04-06
申请号：CN201711352455.X
申请日：2017-12-15
Applicant: 江南大学
IPC: C12N9/06 , C12N15/53 , C12N15/70 , C12N1/21 , C12P7/40 , C12P13/04 , C12P35/02 , C12Q1/26 , C12R1/19
Abstract: 本发明公开了一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，在甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸。本发明得到的突变体获得的体积酶活比野生型提高3.4倍。同时突变体经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L-1·h-1，为圆冬红酵母在大肠杆菌中表达获得的最高酶活，加强了该酶的工业应用潜力。
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公开(公告)号：CN106399216A
公开(公告)日：2017-02-15
申请号：CN201611006643.2
申请日：2016-11-16
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。本发明将L-苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶及提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因串联表达构建重组的大肠杆菌单细胞工厂用于α-氨基丁酸高效合成，通过rbs序列优化控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量，解决中间产物酮丁酸的快速积累而抑制转化的问题，同时通过启动子及rbs序列优化控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量，增强NADH再生速率最终增加产量。利用单细胞工厂进行全细胞转化可减少物质进出障碍加快转化速率，促进辅因子胞内循环而无需外源添加，成本低廉。在20h内，5L发酵罐中重组大肠杆菌单细胞工厂产量为204g/L，时空产率10.2g/L·h，为其工业化生产提供实际有效策略。
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