公开(公告)号：CN102660610A

公开(公告)日：2012-09-12

申请号：CN201210172930.6

申请日：2012-05-31

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈敬华 ,  刘卫超 ,  王敏 ,  王蕴聪 ,  张頔

IPC: C12P19/18 ,  C12P19/04

Abstract: 本发明公开了一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法。本发明制备高活性低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用HepI(组氨酸标签肝素酶I)控制性降解后，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶对其进行选择性修饰，增加抗凝活性中心的数量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。本发明方法所采用的HepI、3-O-硫酸基转移酶、AST-Ⅳ可通过高密度发酵高产量制备；所述PAPS再生系统，以PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本。本发明为高活性低分子量肝素的酶法工业化提供了新的途径。

公开(公告)号：CN102911981A

公开(公告)日：2013-02-06

申请号：CN201210464124.6

申请日：2012-11-19

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈敬华 ,  刘卫超 ,  周斌 ,  王敏 ,  程咏梅 ,  滕丽萍 ,  陈荆晓

IPC: C12P19/04

Abstract: 本发明公开了一种制备高活性低毒副作用肝素的方法。本发明制备高活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素为底物，采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶、2-O-脱硫酸基酶对其进行选择性修饰，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本发明方法所采用的3-O-硫酸基转移酶、2-O-脱硫酸基酶可通过发酵制备；所述PAPS再生系统，以PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本，使工业化成为可能。本发明为工业化制备高活性低毒副作用肝素提供了新的途径。

公开(公告)号：CN102899307A

公开(公告)日：2013-01-30

申请号：CN201210464123.1

申请日：2012-11-19

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈敬华 ,  周斌 ,  刘卫超 ,  王敏 ,  程咏梅 ,  滕丽萍 ,  邓超

IPC: C12N9/88 ,  C12N9/10 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明利用实验室保藏的分别携带2-O位脱硫酸化酶基因、3-O位硫酸基转移酶基因的两种质粒，首先通过转化得到重组工程菌；然后在摇瓶中优化了重组菌的生长和诱导产酶等条件，得到大量的2-O位脱硫酸化酶与3-O位硫酸基转移酶；最后将粗酶通过镍柱(Ni-NTA Agarose Fast Flow)进行纯化，快速得到了纯度高达90％的纯酶。在摇瓶优化的基础上，进行高密度发酵，采用提高单位体积菌体浓度的方法进一步提高了两种酶的产量，能够极大地降低两种酶的生产成本，使工业化成为可能，为我们探索和研究肝素多糖的构效关系、硫酸乙酰肝素的作用奠定基础。