公开(公告)号：CN102787114B

公开(公告)日：2015-06-17

申请号：CN201210284031.5

申请日：2012-08-11

Applicant: 复旦大学

Inventor： 卢大儒 ,  周翔达 ,  宋晓 ,  孙海燕 ,  陈红岩

IPC: C12N15/10

Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，具体为一种定向无缝DNA片段连接方法。本发明的连接引物两端要与待连接DNA片段2a和3a的待连接处两侧各有5-40个碱基的序列完全互补；由于引物的tm值随着碱基数量和GC含量的增加变高，而完成连接反应的Taq DNA连接酶活性的温度区间在65℃~50℃之间，所以连接引物1与单个待连接片段之间的互补碱基数量应使连接引物与单个待连接片段之间的tm值处于50℃~65℃之间；将片段先行磷酸化，或者将引物磷酸化，然后进行PCR扩增，以保证待连接片段的5’端带有磷酸基团。本发明的连接过程中不发生顺序错位，不产生串联寡聚体，不产生载体和片段的自连环化，操作自由度高，操作简单，周期短，价格低廉。

公开(公告)号：CN102787114A

公开(公告)日：2012-11-21

申请号：CN201210284031.5

申请日：2012-08-11

Applicant: 复旦大学

Inventor： 卢大儒 ,  周翔达 ,  宋晓 ,  孙海燕 ,  陈红岩

IPC: C12N15/10

Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，具体为一种定向无缝DNA片段连接方法。本发明的连接引物两端要与待连接DNA片段2a和3a的待连接处两侧各有5-40个碱基的序列完全互补；由于引物的tm值随着碱基数量和GC含量的增加变高，而完成连接反应的TaqDNA连接酶活性的温度区间在65℃~50℃之间，所以连接引物1与单个待连接片段之间的互补碱基数量应使连接引物与单个待连接片段之间的tm值处于50℃~65℃之间；将片段先行磷酸化，或者将引物磷酸化，然后进行PCR扩增，以保证待连接片段的5’端带有磷酸基团。本发明的连接过程中不发生顺序错位，不产生串联寡聚体，不产生载体和片段的自连环化，操作自由度高，操作简单，周期短，价格低廉。