运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用

    公开(公告)号:CN104109687A

    公开(公告)日:2014-10-22

    申请号:CN201410332921.8

    申请日:2014-07-14

    Applicant: 四川大学

    Abstract: 构建CRISPR-Cas系统表达质粒pSUZM1a-Cas9,pSUZM2a-Cas9,pSUZM3a-Cas9,包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。构建表达质粒pUC-T7sgRNA,含复制起点、筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。设计相应的靶序列,DNA模板经T7RNA聚合酶体外转录,经纯化后获得的sgRNA与Cas9基因表达质粒共电转化大肠杆菌和Z.mobilisZM4。结果表明,利用CRISPR技术能够成功敲除大肠杆菌DH5α的upp基因、有效地消除运动单胞菌中的天然质粒。在研究过程中所建立的Cas9基因表达质粒、sgRNA表达质粒以及成套研究方法可以广泛地用于运动发酵单胞菌基因组中基因的敲除,具有很好的市场应用前景。

    运动发酵单胞菌表达载体pSUZM系列及其构建方法

    公开(公告)号:CN104212829A

    公开(公告)日:2014-12-17

    申请号:CN201410301875.5

    申请日:2014-06-30

    Applicant: 四川大学

    Abstract: 本发明公开了一类表达载体pSUZM1a、pSUZM1b、pSUZM1c;pSUZM2a、pSUZM2b、pSUZM2c和pSUZM3a、pSUZM3b、pSUZM3c及其构建方法。所述的表达载体是一类环状载体,这些载体都包含来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点和卡那霉素筛选标记基因。其中pSUZM1(a,b,c)还包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、pSUZM2(a,b,c)包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点、pSUZM3(a,b,c)包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制起点。pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a包含来自于运动发酵单胞菌的启动子Ppdc;pSUZM1b、pSUZM2b、pSUZM3b包含来自于载体pKD46的启动子Para;pSUZM1c、pSUZM2c、pSUZM3c包含来自于载体pGEX的tac启动子。通过本发明的方法,实现了外源基因的在运动发酵单胞菌中的高效表达,具有很好的应用前景。

    运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒及其构建方法与应用

    公开(公告)号:CN104152482A

    公开(公告)日:2014-11-19

    申请号:CN201410332018.1

    申请日:2014-07-14

    Applicant: 四川大学

    Abstract: 本发明公开了6个用于运动发酵单胞菌的RecET重组系统表达质粒pSUZM1a-RecET(RecE588T)、pSUZM2a-RecET(RecE588T)、pSUZM3a-RecET(RecE588T)及其构建方法与应用。这6个表达质粒都包含卡那霉素筛选标记基因、组成型启动子Ppdc和RecET(或RecE588T)基因。其区别在于质粒pSUZM1a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pSUZM2a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401上的复制蛋白序列、质粒pSUZM3a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列。把表达质粒转入Z. mobilis,在敲入的筛选标记基因同源臂为60bp时,敲入基因能够准确地替换靶基因。本发明的质粒具有很好的应用前景。

    运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM系列及其构建方法

    公开(公告)号:CN104031932A

    公开(公告)日:2014-09-10

    申请号:CN201410296217.1

    申请日:2014-06-27

    Applicant: 四川大学

    Abstract: 本发明公开了一类运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3及其构建方法。所述的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体是一类环状载体,pSUZM1包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点,卡那霉素筛选标记基因;pSUZM2包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因;pSUZM3包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制起点、DNA复制蛋白基因序列和来自于质粒pUC18上的大肠杆菌质粒复制起点、卡那霉素筛选标记基因。本发明的穿梭载体既能在大肠杆菌中复制,又能在运动发酵单胞菌中复制,并且在运动发酵单胞菌中能够稳定的遗传,具有很好的应用前景。

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