公开(公告)号：CN114657213B

公开(公告)日：2022-08-02

申请号：CN202210559369.0

申请日：2022-05-23

Applicant: 华南农业大学

Inventor： 马静云 ,  燕晓玲 ,  符军

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/65 ,  C12N15/64 ,  C12N1/21 ,  C12N7/01 ,  C12Q1/02 ,  A61K39/215 ,  A61P31/14 ,  C12R1/93 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用。本发明利用Gibson组装将猪急性腹泻综合征冠状病毒基因组分段克隆到大肠杆菌的细菌人工染色体中，并将全长感染性克隆和辅助质粒共转染哺乳动物细胞快速拯救得到与野生型亲本基因相同的病毒。本发明绕过了传统方法繁琐的酶切位点设计和酶切连接操作，且病毒BAC在大肠杆菌中是稳定的，可以通过DNA同源重组工程和反向筛选系统进行进一步的基因操作。同时，本发明成功构建了毒株SADS‑CoV‑WT的感染性克隆并建立了基于DNA同源重组工程和ccdB反向筛选系统于辅助蛋白基因ORF3a和ORF7a/b位置进行敲除或插入外源基因的方法。

公开(公告)号：CN114657213A

公开(公告)日：2022-06-24

申请号：CN202210559369.0

申请日：2022-05-23

Applicant: 华南农业大学

Inventor： 马静云 ,  燕晓玲 ,  符军

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/65 ,  C12N15/64 ,  C12N1/21 ,  C12N7/01 ,  C12Q1/02 ,  A61K39/215 ,  A61P31/14 ,  C12R1/93 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用。本发明利用Gibson组装将猪急性腹泻综合征冠状病毒基因组分段克隆到大肠杆菌的细菌人工染色体中，并将全长感染性克隆和辅助质粒共转染哺乳动物细胞快速拯救得到与野生型亲本基因相同的病毒。本发明绕过了传统方法繁琐的酶切位点设计和酶切连接操作，且病毒BAC在大肠杆菌中是稳定的，可以通过DNA同源重组工程和反向筛选系统进行进一步的基因操作。同时，本发明成功构建了毒株SADS‑CoV‑WT的感染性克隆并建立了基于DNA同源重组工程和ccdB反向筛选系统于辅助蛋白基因ORF3a和ORF7a/b位置进行敲除或插入外源基因的方法。