公开(公告)号：CN109680080B

公开(公告)日：2023-01-03

申请号：CN201811514580.0

申请日：2018-12-12

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 储岳峰 ,  翟肖辉 ,  郝华芳 ,  陈胜利 ,  颜新敏 ,  刘永生

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6844 ,  C12Q1/04 ,  C12R1/35

Abstract: 本发明公开了一种牛支原体的nfo‑RPA检测方法及检测试剂盒。本发明通过以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b‑specific‑Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。相应的，本发明的检测试剂盒，其成分除了商品化的Freeze‑dried reaction，280mM MgAc，Rehydration buffer，Test device和PCRD Extraction buffer外，主要包括特别设计的牛支原体特异性的引物、探针及配套试剂：M.b‑specific‑Forward，M.b‑specific‑Reverse，M.b‑specific‑Probe，Nuclease‑free water，阳性对照模板。本发明除了用于实验室常规检测牛支原体核酸外，特别适用于无实验室条件下(如基层兽医部门、养殖场等)的现场检测，具有高特异性和灵敏性，是一种快速、准确的牛支原体核酸检测试剂盒，具有良好的应用前景。

公开(公告)号：CN112176104A

公开(公告)日：2021-01-05

申请号：CN202011070808.9

申请日：2020-10-09

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 张杰 ,  汪洋 ,  丁耀忠 ,  张维兵 ,  李彦 ,  马炳 ,  代军飞 ,  李茜 ,  侯谦 ,  李苗苗 ,  孙跃峰 ,  陈豪泰 ,  刘永生 ,  张永光

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了一种猪圆环病毒3型的可视化LAMP检测试剂盒，该试剂盒是包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒以中性红为显色染料，使肉眼直观效果更加鲜明，阳性反应为粉红色，阴性反应为橘黄色，而且还实现了由试剂盒直接提供含有颜料的反应预混缓冲液的需求，这样不仅简化了操作程序，还有效避免污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，不仅能够以从临床样品中提取的DNA为扩增模板，而且还能够直接以全血或者血清为模板扩增，反应结果直接肉眼观察判断，具有良好的特异性和敏感性，需求设备简单(恒温热块即可)，操作便捷，不需要特殊技术人员，适于各种检测环境，尤其是现场使用。

公开(公告)号：CN111793722A

公开(公告)日：2020-10-20

申请号：CN202010787407.9

申请日：2020-08-07

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 丁耀忠 ,  张杰 ,  张中旺 ,  马维民 ,  何继军 ,  刘永生 ,  陈豪泰

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6851 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明涉及一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组，包括引物F1、引物F2、引物R和探针，所述引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针为在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。应用本发明所述引物探针组进行检测具有良好的特异性和敏感性，与1型猪繁殖与呼吸综合征没有任何反应，具有很好的临床应用价值。

公开(公告)号：CN111778221A

公开(公告)日：2020-10-16

申请号：CN202010652309.4

申请日：2020-07-08

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 李茜 ,  丁耀忠 ,  马维民 ,  代军飞 ,  汪洋 ,  侯谦 ,  李苗苗 ,  马炳 ,  刘永生 ,  张永光

IPC: C12N7/01 ,  C12N15/866 ,  C07K19/00 ,  A61K39/295 ,  A61K39/125 ,  A61K39/135 ,  A61P31/14 ,  A61P31/20 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白表面Loop2区和Loop4区后分别嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，在N端嵌一个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1925OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B4B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在70KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白NT1L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可以应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。

公开(公告)号：CN111087452A

公开(公告)日：2020-05-01

申请号：CN201911309242.8

申请日：2019-12-18

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 汪洋 ,  丁耀忠 ,  李国秀 ,  欧云文 ,  代军飞 ,  李茜 ,  马炳 ,  张杰 ,  侯谦 ,  刘永生

IPC: C07K14/01 ,  C12N15/66 ,  C12N15/70 ,  C07K19/00

Abstract: 本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL-C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL-MBP-HisSUMO-Cap重组表达载体，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。

公开(公告)号：CN106591177B

公开(公告)日：2020-04-21

申请号：CN201611070622.7

申请日：2016-11-29

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 储岳峰 ,  郝华芳 ,  陈胜利 ,  赵萍 ,  刘永生

IPC: C12N1/20 ,  A61K39/02 ,  A61P31/04 ,  A61P11/00 ,  C12R1/35

Abstract: 本发明公开了一种山羊支原体山羊肺炎亚种低血清高效培养基，含有以下组分：PPLO肉汤、丙酮酸钠、乳糖、胰蛋白胨、新鲜酵母浸出液、L‑谷氨酰胺、L‑半胱氨酸、水解乳蛋白、马血清、青霉素、酚红、去离子水；并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的山羊支原体山羊肺炎亚种培养基血清含量仅为5%，仅为现有技术培养基血清量的1/5～1/4；此外，用本发明方法制备的半成品菌液滴度达1010 CCU/ml，明显高于现有技术培养基。本发明低血清高效培养基培养山羊支原体山羊肺炎亚种，既有利于减轻异源血清对羊体的过敏应激反应，提高生物安全，又提高了活菌滴度，降低了生产成本。

公开(公告)号：CN108508210B

公开(公告)日：2019-10-18

申请号：CN201810149238.9

申请日：2018-02-13

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 张杰 ,  张永光 ,  丁耀忠 ,  刘永生 ,  代军飞 ,  王俊 ,  马炳 ,  欧云文 ,  孙跃峰 ,  吕建亮 ,  邵军军 ,  周鹏

IPC: G01N33/68 ,  C12N15/70 ,  C12N15/40 ,  C07K14/08

Abstract: 本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。

公开(公告)号：CN110305975A

公开(公告)日：2019-10-08

申请号：CN201910374763.5

申请日：2019-05-07

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 宫晓炜 ,  陈启伟 ,  郑福英 ,  刘永生

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11 ,  C12R1/35

Abstract: 本发明公开了一种快速检测鸡滑液囊支原体的RPA试剂盒及其检测方法。该试剂盒包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液，醋酸镁，一对引物及一条探针。实验证明本发明的试剂盒灵敏度和特异性与qPCR法相当，整个反应时间在20min内完成，检测结果仅需要通过荧光曲线改变来判定。因此，本发明的试剂盒具有快捷、高效、灵敏等优点，不仅为有效检测和鉴定鸡滑液囊支原体提供了技术手段，而且操作简便、快速、适用于临床兽医现场诊断和对鸡滑液囊支原体的科学研究。

公开(公告)号：CN106435016B

公开(公告)日：2019-07-26

申请号：CN201610760228.X

申请日：2016-08-30

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 张杰 ,  刘永生 ,  丁耀忠 ,  陈豪泰 ,  张永光 ,  马丽娜 ,  潘丽 ,  王永录 ,  常慧芸 ,  邵军军 ,  张中旺 ,  吕建亮 ,  林彤 ,  刘新生

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明提供一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的LAMP试剂盒，该试剂盒包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒在不延长原有1小时反应时间的条件下，实现了将荧光染料直接加入反应管的一步操作，不仅简化了操作程序，解决了含有钙黄素的预混染料对Bst DNA扩增酶的抑制而导致在反应管直接加入荧光染料不显色的根本问题，还有效避免了由于反应结束后二次开盖导致的释放产物形成气溶胶的污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。

公开(公告)号：CN109777762A

公开(公告)日：2019-05-21

申请号：CN201910205102.X

申请日：2019-03-18

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 敬文宪 ,  李学瑞 ,  马丽娜 ,  周建华 ,  兰喜 ,  刘永生

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/90 ,  G01N33/569 ,  C12R1/42

Abstract: 本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌基因组基因标签标记方法，包括以下步骤：(1)构建鼠伤寒沙门氏菌/pKD46菌株；(2)构建鼠伤寒沙门氏菌::cpxP::kansacB/pKD46菌株；(3)构建鼠伤寒沙门氏菌::cpxP::3×Flag菌株。本发明可以通过常用的标签单克隆抗体对目的基因在蛋白水平上的表达状况进行分析，既提高了特异性，灵敏度，又省去了制作各个目的基因多克隆抗体或抗体的步骤，为在研究基因在蛋白水品表达变化提供了有力的支持，使研究基因的功能更加的精细，准确。