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公开(公告)号：CN106591364A
公开(公告)日：2017-04-26
申请号：CN201611001075.7
申请日：2016-11-14
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , A01K67/027
CPC classification number: C12N15/85 , A01K67/0276 , A01K2227/101 , A01K2267/02 , C07K14/47 , C12N5/0656 , C12N2800/107 , C12N2800/80
Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。
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公开(公告)号：CN105420200A
公开(公告)日：2016-03-23
申请号：CN201610033932.5
申请日：2016-01-19
Applicant: 西北农林科技大学
CPC classification number: C12N7/00 , C12N2740/12021
Abstract: 本发明公开了一种羊肺腺瘤病毒的体外稳定培养方法，该方法包括以下步骤：分离、纯化和培养患肺腺瘤的羊肺泡Ⅱ型细胞，设计并合成核苷酸序列(上游：5’-GATCCGGCCGGTGCTTCTAGGAATATTCAAGACGTAATCCTAGGAGCACCGGCATTTTTGTCGACA-3’，下游：5’-AGCTTGTCGACAAAAATGCCGGTGCTCCTAGGATTACGTCTTGAATATTCCTAGAAGCACCGGCCG-3’)，构建siRNA干扰载体，将siRNA干扰载体转染肺泡Ⅱ型细胞。本发明的有益之处在于：本发明的培养方法通过siRNA技术让exJSRV在体外培养的细胞中稳定增殖。
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公开(公告)号：CN103820494B
公开(公告)日：2016-03-02
申请号：CN201410073055.5
申请日：2014-02-28
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用，包括pUC ori、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一loxP序列和第一rox序列，CMV启动子连接在第一loxP序列的上游，负筛选基因与第一rox序列相连接，负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2，IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二rox序列和第二loxP序列，并且分别与第一rox序列和第一loxP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。本发明为在细胞筛选中提供剔除随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞的新的应用。
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公开(公告)号：CN104726495A
公开(公告)日：2015-06-24
申请号：CN201510131862.2
申请日：2015-03-25
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N15/55 , C12N15/12 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。本发明根据山羊β-乳球蛋白基因，设计并构建了针对其第一外显子的TALEN真核表达载体以及含有较短同源臂的BLG基因敲除载体，与以TALEN表达载体为模板体外转录的mRNAs共同转染山羊胎儿成纤维细胞，经药物筛选及鉴定后得到β-乳球蛋白基因敲除细胞。本发明利用TALEN技术大大提高了基因打靶效率，同时较短同源臂的利用可以更方便高效的进行中靶细胞的筛选，mRNAs的利用则避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合。
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公开(公告)号：CN103820494A
公开(公告)日：2014-05-28
申请号：CN201410073055.5
申请日：2014-02-28
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种可去除随机整合的位点特异性整合载体及其构建方法和应用，包括pUC？ori、attB序列和多克隆位点MCS，在attB序列上下游分别设有第一loxP序列和第一rox序列，CMV启动子连接在第一loxP序列的上游，负筛选基因与第一rox序列相连接，负筛选基因下游还连接有内核糖体结合位点IRES2，IRES2下游为荧光标记基因，荧光标记基因下游为MCS，MCS上下游分别设有第二rox序列和第二loxP序列，并且分别与第一rox序列和第一loxP序列方向相同，MCS下游为正筛选元件。本发明为在细胞筛选中提供剔除随机整合重组细胞而直接筛选出假attP位点特异整合的重组细胞的新的应用。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN102676559B
公开(公告)日：2013-10-23
申请号：CN201110390905.0
申请日：2011-11-30
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/57 , C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873 , C12R1/44
Abstract: 本发明公开了一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞，重组溶葡萄球菌素基因由牛生长激素信号肽加上突变的溶葡萄球菌素成熟肽组成，在他的5′端和3′端加入酪蛋白基因的调控序列，在酪蛋白5′端和EGFP的终止密码子后各添加一个鸡β乳球蛋白的绝缘子元件。用整合了目的基因的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚胎。通过胚胎移植技术将发育正常的转基因克隆胚胎，有望生产出转重组溶葡萄球菌素基因的抗乳房炎的高产奶牛。
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公开(公告)号：CN102321655B
公开(公告)日：2013-08-28
申请号：CN201110259942.8
申请日：2011-09-05
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/63
Abstract: 本发明公开了一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用，该表达载体包括attB序列、pUC ori和多克隆位点MCS，CMV组成型启动子与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素表达元件。该载体可应用于筛选稳定表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞。
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公开(公告)号：CN103160534A
公开(公告)日：2013-06-19
申请号：CN201310100213.7
申请日：2013-03-26
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体及其构建方法。所构建的载体包括5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。本发明通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率；然后利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点上，在打靶载体筛选基因和标记基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除筛选基因和标记基因，从而提高体细胞克隆的效率。
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公开(公告)号：CN102533821B
公开(公告)日：2013-06-05
申请号：CN201110413178.5
申请日：2011-12-12
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/57 , C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873 , A01K67/027
Abstract: 本发明公开了一种重组溶葡萄球菌素基因及其构建的表达载体和重组细胞。重组溶葡萄球菌素基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，构建含有重组溶葡萄球菌素基因和绿色荧光蛋白基因的乳腺特异性表达载体pBELS，其次用Fugen HD将乳腺特异表达载体pBELS转染高产奶牛耳成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得转基因阳性细胞，进行PCR和Southern bloting鉴定，证实重组溶葡萄球菌素基因整合到牛耳成纤维细胞的基因组中。用生长状态良好的阳性转基因细胞作为核供体，构建转基因胚胎进行胚胎移植到同步化的受体牛子宫中，获得了转溶葡萄球菌素基因的奶牛。
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公开(公告)号：CN102807993A
公开(公告)日：2012-12-05
申请号：CN201210319587.3
申请日：2012-08-31
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞，首先构建含有靶向Myostatin基因的pre-miRNA和MYL1基因启动子的骨骼肌特异性miRNA表达载体pmiR-MNM2，然后通过电转染法将外源性表达载体pmiR-MNM2导入红安格斯新生牛成纤维细胞并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；将转染pmiR-MNM2的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫，为生产具有双肌性状的红安格斯克隆牛奠定了坚实的基础。
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