公开(公告)号：CN105695581B

公开(公告)日：2020-03-10

申请号：CN201610136155.7

申请日：2016-03-10

Applicant: 东华大学 ,  上海翼和应用生物技术有限公司

Inventor： 肖君华 ,  胡世贤 ,  徐福义 ,  王茂春 ,  陈科 ,  白杨 ,  陈义群 ,  周梁梁 ,  李凯 ,  周宇荀

IPC: C12Q1/6869

Abstract: 本发明涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：按照多个基因的相对表达量将相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；构建标准品竞争性模板和待测样品竞争性模板，进行三轮多重竞争性PCR反应；混合第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并分析，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。本发明基于高速发展的二代测序平台，准确快速定量目标模板和内参照模板，并可以同时对多个样本进行5个目的基因表达差异分析，流程简单易行，价格低廉；当需要分析多样本间多基因表达差异时，不失为一种具有高准确度，通量适中，成本廉价的方法。

公开(公告)号：CN104651401B

公开(公告)日：2019-03-08

申请号：CN201510098102.6

申请日：2015-03-05

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  邓倩云 ,  常雪莹 ,  王斯佳 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/65 ,  C12N15/113

Abstract: 本发明涉及一种mir‑505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir‑505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir‑505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir‑505进行敲除，通过荧光筛选得到mir‑505双等位基因敲除的细胞。本发明为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。

公开(公告)号：CN103866009B

公开(公告)日：2016-08-17

申请号：CN201410067044.6

申请日：2014-02-26

Applicant: 东华大学

Inventor： 薛慧慧 ,  肖君华 ,  周宇荀 ,  李凯

IPC: C12Q1/68

Abstract: 本发明涉及一种改进的茎环引物qRT?PCR检测miRNA的方法，包括：（1）miRNA检测引物的设计：茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；（2）将靶标miRNA反转录成cDNA；（3）定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。本发明的方法特异性好、灵敏性高，且只需合成一种下游引物，采用SYBR Green I荧光染料法，大大节约了成本。

公开(公告)号：CN105567718A

公开(公告)日：2016-05-11

申请号：CN201610044291.3

申请日：2016-01-22

Applicant: 东华大学

Inventor： 周宇荀 ,  李晓宁 ,  李文文 ,  王斯佳 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/85

CPC classification number: C12N15/66 ,  C12N15/85 ,  C12N2800/107 ,  C12N2800/80 ,  C12N2810/10

Abstract: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。

公开(公告)号：CN104388456A

公开(公告)日：2015-03-04

申请号：CN201410605326.7

申请日：2014-10-31

Applicant: 东华大学

Inventor： 邓倩云 ,  周宇荀 ,  常雪莹 ,  王斯佳 ,  肖君华 ,  李凯

IPC: C12N15/66

Abstract: 本发明涉及一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，包括：体外合成单链核苷酸链，并形成DNA双链片段；利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片段，电泳进行鉴定；42229载体用Bbs I进行酶切，线性化后的载体42229和退火延伸后的插入片段通过同源重组的方法进行片段插入，即可。本发明在多基因位点敲除中简化后续的载体纯化和转染步骤，提高基因敲除的效率。

公开(公告)号：CN101463389A

公开(公告)日：2009-06-24

申请号：CN200810207238.6

申请日：2008-12-18

Applicant: 东华大学

Inventor： 王勤熙 ,  李凯 ,  赵丽亚 ,  周宇荀 ,  肖君华

IPC: C12Q1/68

Abstract: 本发明涉及基于荧光通用引物的多重定量RT－PCR基因表达谱分析方法，包括下列步骤：(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计，通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；(2)多重RT－PCR反应过程；(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。本发明适用于10－30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。

公开(公告)号：CN203329755U

公开(公告)日：2013-12-11

申请号：CN201320287927.9

申请日：2013-05-23

Applicant: 东华大学

Inventor： 肖君华 ,  陈科 ,  徐福义 ,  晁天柱 ,  周宇荀 ,  李凯

IPC: B01L9/06

Abstract: 本实用新型提供了一种单面96孔易于多孔道移液器取样的离心管架，其特征在于，包括长方体形的底座，底座的上表面为孔洞排布面，孔洞排布面上设有96个孔洞，所述的96个孔洞沿孔洞排布面的长度方向排列为12列，沿孔洞排布面的宽度方向排列为8行。与现有技术相比，本实用新型的有益效果是，可以在稳定直立摆放1.5毫升离心管的同时，方便地使用多孔道移液器取样和加样，操作简单，使实验准确快速进行。