公开(公告)号：CN103131660A

公开(公告)日：2013-06-05

申请号：CN201310092849.1

申请日：2013-03-21

Applicant: 浙江大学

Inventor： 张奇春 ,  王京文 ,  侯昌萍

IPC: C12N1/20

Abstract: 本发明公开了一种以抗生素为碳源生长的土壤微生物的分离方法，包括以下步骤：1）制备含有(NH4)2SO4 、MgSO4.7H2O、EDTA等成分的液态单一碳源介质；2）、利用液态单一碳源介质制备液体抗性培养基、固体抗性培养基；3）、用液体抗性培养基将菌悬液稀释至菌悬液的体积浓度为0.1%的土壤稀释液；4）、在超菌台上，将土壤稀释液涂布在固体抗性培养基上；然后室温静止5~10 min；接着，将固体抗性培养基倒置于恒温培养箱29~31℃下培养，直至固体抗性培养基表面长出菌落，再通过平板划线得到纯培养物，纯培养物为土壤细菌。采用本发明的方法分离土壤微生物具有操作简便、分离效果好等特点。

公开(公告)号：CN103981263B

公开(公告)日：2016-06-29

申请号：CN201410198989.1

申请日：2014-05-12

Applicant: 浙江大学

Inventor： 张奇春 ,  侯昌萍

IPC: C12Q1/68

Abstract: 本发明公开了一种土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：1)、选用经常服用抗生素的猪，以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；2)、切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB平板后挑选阳性克隆子；3)、用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；4)、提取土壤的基因组DNA，将土壤样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，从而最终得出土壤样品的抗性基因的拷贝数。

公开(公告)号：CN103981263A

公开(公告)日：2014-08-13

申请号：CN201410198989.1

申请日：2014-05-12

Applicant: 浙江大学

Inventor： 张奇春 ,  侯昌萍

IPC: C12Q1/68

CPC classification number: C12Q1/6851 ,  C12Q2531/113 ,  C12Q2537/16 ,  C12Q2545/113

Abstract: 本发明公开了一种土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：1)选用经常服用抗生素的猪，以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；2)切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB平板后挑选阳性克隆子；3)用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；4)提取土壤的基因组DNA，将土壤样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，从而最终得出土壤样品的抗性基因的拷贝数。