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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN101921737A
公开(公告)日：2010-12-22
申请号：CN200910264846.5
申请日：2009-12-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明以本研究室构建的高产耐热性重组Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl为出发菌，对其发酵液进行提取并分离纯化得到电泳纯β-1，3-1，4-葡聚糖酶样品。主要研究冻融法、酶法和超声破碎法破壁对酶活力的影响，考察硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀的特点，最后采用离子交换层析获得了较纯的重组酶，并用SDS-PAGE进行鉴定。重组β-葡聚糖酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22.57倍，回收率为20.06％，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β-葡聚糖酶为一单一条带，分子量大小约为27kDa。
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公开(公告)号：CN101899458B
公开(公告)日：2011-12-21
申请号：CN200910264850.1
申请日：2009-12-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了基因工程领域中的一种巴斯德毕赤酵母重组菌及其应用。本研究室通过体外分子进化技术，对淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了热稳定性提高定向进化，获得多株热稳定性提高突变体。本发明首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了其中一株热稳定提高最明显β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建到AOX I甲醇诱导型启动子下游，得到重组质粒pPICZαA-his6-bgl，将其经Pme I线性化后转化毕赤酵母GS115，bgl基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上，并处于酵母α因子的下游，实现了异源分泌表达。通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD600为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。
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公开(公告)号：CN102021191A
公开(公告)日：2011-04-20
申请号：CN200910264847.X
申请日：2009-12-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 定向进化技术是由美国工程院院士、加州理工学院化工系教授FrancesH.Arnold于90年代初期开发出来的一项蛋白质工程技术。它是基因工程、蛋白质结构和计算机技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、耐热性好、pH稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的主要问题。本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。
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公开(公告)号：CN102010887A
公开(公告)日：2011-04-13
申请号：CN200910264848.4
申请日：2009-12-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 高通量筛选是一种同时分析多个样本的方式，从大量样本中挑选出符合目标的个体，目前广泛应用于药物开发、酶的发现和改造方面。体外定向进化作为后基因组时代一个重要的技术平台正得到日益广泛的应用。定向进化技术在改造酶的热稳定性方面已表现出一定的优越性，而将这一技术应用在β-葡聚糖酶热稳定性定向进化上国内外尚未有相关报道。采用定向进化技术对β-葡聚糖酶的热稳定性改造过程中，如何快速有效地筛选得到目标突变体是其瓶颈问题之一。本发明建立了基于酶标仪、96微孔板和环境压力的热稳定性提高突变体高通量筛选模型，见附图1。该发明将96微孔板菌落的诱导表达与菌落的原位复制技术有机结合起来，以β-葡聚糖酶与蓝色葡聚糖底物作用后释放蓝色基团特性为基础，以各孔酶反应液的吸光值大小为指标建立了直观、快速简易的高通量筛选方法。通过该方法可以筛选到热稳定性和催化活性同时提高的变异体且稳定性良好。对该方法的筛选稳定性考察结果显示，其精密度良好，RSD为8.1％，重现性达到100％，假阳性率及假阴性较低，分别为6.25％及2.1％。
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公开(公告)号：CN101899458A
公开(公告)日：2010-12-01
申请号：CN200910264850.1
申请日：2009-12-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了基因工程领域中的一种巴斯德毕赤酵母重组菌及其应用。本研究室通过体外分子进化技术，对淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了热稳定性提高定向进化，获得多株热稳定性提高突变体。本发明首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了其中一株热稳定提高最明显β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建到AOX I甲醇诱导型启动子下游，得到重组质粒pPICZαA-his6-bgl，将其经Pme I线性化后转化毕赤酵母GS115，bgl基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上，并处于酵母α因子的下游，实现了异源分泌表达。通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD600为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。
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