公开(公告)号：CN106434735A

公开(公告)日：2017-02-22

申请号：CN201610892831.3

申请日：2016-10-12

Applicant: 江南大学

Inventor： 孙付保 ,  张云博 ,  张震宇 ,  白仁惠 ,  杨慧敏 ,  王春迪

IPC: C12N15/81 ,  C12N9/42 ,  C12R1/84

CPC classification number: C12N15/815 ,  C12N9/2482 ,  C12N2800/22 ,  C12Y302/01008

Abstract: 本发明公开提供了一种提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素水解辅助酶蛋白在毕赤酵母中异源表达量的方法。本发明通过毕赤酵母密码子偏好的特性，对来源于黑曲霉Aspergillus niger的木聚糖酶(XynC)基因进行密码子优化，其优化后的核苷酸序列(AxynC)经人工合成，并构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC。利用两步电击转化法，构建高产木聚糖酶的重组毕赤酵母，即将线性化的pPIC9K-AxynC转化毕赤酵母GS115，获得了一株产酶能力较强的菌株。以该高酶活菌株作为宿主菌进行第二次电击转化，将线性化的pPICZαA-AxynC电击转化该菌株，获得了一株高产木聚糖酶的双质粒重组毕赤酵母。通过检测表明，经过密码子优化的木聚糖酶基因能够在毕赤酵母中成功表达，而且利用两步电击转化法构建的高产木聚糖酶重组菌能稳定高效生产木聚糖酶，摇瓶

公开(公告)号：CN104371990A

公开(公告)日：2015-02-25

申请号：CN201410665840.X

申请日：2014-11-19

Applicant: 江南大学

Inventor： 孙付保 ,  白仁惠 ,  张云博 ,  张震宇 ,  沈松 ,  周邦炜

IPC: C12N9/42

CPC classification number: C12N9/2437 ,  C12N9/2445 ,  C12Y302/01004 ,  C12Y302/01021 ,  C12Y302/01091

Abstract: 本发明涉及到纤维素酶分离纯化方法。本方法首先调节纤维素酶蛋白浓度至3mg/mL～8mg/mL，通过高精度强阴离子柱层析，利用线性与梯度相结合的洗脱方式对纤维素酶液进行初步分离，真空冷冻浓缩至冻干粉，用pH4.0～6.0缓冲液溶解，然后再通过凝胶柱层析，并采用蛋白电泳进行纯度检测，最后通过质谱检测，从而达到高效、精确分离提纯纤维素酶单酶组分的目的。与现有的方法对比，本方法可以实现酶蛋白单一组分的快速高效和精确分离，并能一次性获得多个单酶组分。

公开(公告)号：CN105441464A

公开(公告)日：2016-03-30

申请号：CN201510801789.5

申请日：2015-11-19

Applicant: 江南大学

Inventor： 孙付保 ,  白仁惠 ,  张震宇 ,  张云博 ,  王春迪

IPC: C12N15/56 ,  C12N15/10 ,  C12N15/81 ,  C12N9/42 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明涉及来源于里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)基因密码子优化及其毕赤酵母表达系统。本发明利用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)对CBH II(NCBI Reference Sequence:XM_006962518.1)进行密码子偏向性优化，构建了pPIC9K-cbh2表达载体，以Pichia pastoris GS115为宿主，通过电转化方法获得转化子。通过检测表明，经过密码子优化的CBH II基因能够在毕赤酵母中稳定高效的表达，重组菌株CMC酶活0.14U/mL，发酵上清液蛋白含量0.15mg/mL。