本发明公开了一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的方法。该方法包括以下步骤：1)取头孢菌素C发酵液进行浓缩，得头孢菌素C浓缩液；2)将头孢菌素C浓缩液进行液相色谱制备柱分离，得脱乙酰氧基头孢菌素C。本发明首次从头孢菌素C发酵液中分离出DOCPC，并且本发明分离纯化得到的DOCPC的纯度在97％以上，这说明本发明能够有效地从头孢菌素C发酵液中分离纯化得到高纯度的DOCPC，这不仅为DOCPC的药理研究提供了可靠的基础，同时也为进一步得到高纯度的DOCPC奠定了基础，具有非常重要的现实意义。