本申请提出一种电子束斑标定装置和方法，装置包括：电子束发生装置、信号采集装置、标定板、真空室和计算机设备。该装置基于计算机设备和信号采集装置的结构，通过计算机设备控制电子束发生装置产生和驱使电子束按照预设轨迹扫描标定板产生过程信号，利用信号采集装置实时采集过程信号，利用计算机设备对过程信号进行处理，确定电子束位置偏差、束斑圆度和束斑尺寸，根据位置偏差、束斑圆度和束斑尺寸，调整电子束发生装置的位置状态矩阵、像散状态矩阵和聚焦状态矩阵，与传统的基于肉眼观察和基于成像的标定方式相比，避免了因视角倾斜导致的图像畸变的影响，具有较高的可靠性高和精度，同时大幅提高了标定效率。