公开(公告)号：CN109666690B

公开(公告)日：2020-05-26

申请号：CN201910045672.7

申请日：2018-02-08

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 沈其荣 ,  缪有志 ,  黄启为 ,  梅慧玲 ,  夏燕维

IPC: C12N15/80 ,  C12N15/90 ,  C12N15/60 ,  C12R1/885

Abstract: 本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5‑FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5‑FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

公开(公告)号：CN108384797B

公开(公告)日：2019-02-26

申请号：CN201810130104.2

申请日：2018-02-08

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 沈其荣 ,  缪有志 ,  黄启为 ,  梅慧玲 ,  夏燕维

IPC: C12N15/80 ,  C12N15/65 ,  C12N15/90 ,  C12N1/15 ,  C12R1/885

Abstract: 本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5‑FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5‑FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

公开(公告)号：CN118006589A

公开(公告)日：2024-05-10

申请号：CN202410156736.1

申请日：2024-02-04

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 缪有志 ,  王景梵 ,  谷金 ,  位亚宁 ,  夏燕维 ,  王伟 ,  徐志辉 ,  张瑞福

IPC: C12N9/42 ,  C12N15/56 ,  C12N1/19 ,  C12N15/81 ,  C12N3/00 ,  C12N1/14 ,  C05F11/08 ,  C05G3/00 ,  A23L2/84 ,  A23K20/189 ,  C12R1/885 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明公开了一种嗜酸性纤维素酶与木聚糖酶组合及其编码基因和应用；所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶XYN1组成；所述EGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EGL2如SEQ ID NO.4所示，所述XYN1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的多酶组合具有极高的酸稳定性(pH0.5‑4.0)，且在pH 1.5‑4.0区间稳定维持高效水解酶活性，能够满足果汁澄清、动物饲料以及微生物肥料木霉孢子生产等酸性应用环境对低pH值下高效水解纤维素的特殊需求。

公开(公告)号：CN109666690A

公开(公告)日：2019-04-23

申请号：CN201910045672.7

申请日：2018-02-08

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 沈其荣 ,  缪有志 ,  黄启为 ,  梅慧玲 ,  夏燕维

IPC: C12N15/80 ,  C12N15/90 ,  C12N15/60 ,  C12R1/885

Abstract: 本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5-FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5-FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

公开(公告)号：CN108384797A

公开(公告)日：2018-08-10

申请号：CN201810130104.2

申请日：2018-02-08

Applicant: 南京农业大学

Inventor： 沈其荣 ,  缪有志 ,  黄启为 ,  梅慧玲 ,  夏燕维

IPC: C12N15/80 ,  C12N15/65 ,  C12N15/90 ,  C12N1/15 ,  C12R1/885

CPC classification number: C12N15/80 ,  C07K14/37 ,  C12N15/65 ,  C12N15/902

Abstract: 本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5-FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5-FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。