本发明公开了一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用，其核苷酸序列包括序列1‑5中所示的DNA分子。核酸适配体可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明首次利用核酸适配体HMX38与甲氨蝶呤的特异性结合作用建立了检测甲氨蝶呤的方法。本发明的核酸适配体及其衍生物可用于制备甲氨蝶呤检测探针、制备药物载体或者用于药物设计与开发、药物分离与纯化等，具有能够与甲氨蝶呤高特异性和高亲和力结合、无免疫原性、能够化学合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存等优点。