本发明提供了一种分离单子叶植物保卫细胞的方法，包括以下步骤：(1)取小麦种子，诱导萌芽；(2)步骤(1)中的小麦种子生长到第一片叶未展开前，将胚芽鞘从种胚处剪断、剥离，将胚芽鞘纵切均分成两半，撕取表皮条；(3)将步骤(2)制得的表皮条置于酶解液中进行酶解；(4)清洗步骤(3)制得的表皮条；(5)将洗好的表皮条置于显微镜下镜检。本发明所述方法，通过使用含有较少类型细胞的小麦胚芽鞘，撕取表皮细胞，再经酶解液的酶解处理，经酶解处理后的胚芽鞘经过清洗，最终获得了高纯度、高活性的哑铃形的小麦保卫细胞，分离出的保卫细胞可用于转录组、蛋白质组和代谢组学研究。