本发明涉及一种酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素的制备方法，该方法用草酸调节乙酰异戊酰泰乐菌素发酵液pH至1～1.5后静置20～30min，用10%～15%的液碱回调pH至4.5～5.5，再次静置20～30min，发酵液经板框过滤、稀释、脱色、纳滤、结晶、水洗、成盐和喷雾干燥后得到酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素。本发明摒弃了常规的结晶工艺，通过提取、结晶和合成工艺实现了提高酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素收率、降低成本，提高其成品质量的制备方法，适用于工业化生产。