本发明提供了一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因(Myostatin)的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞。利用ZFNs介导的基因敲除，可以实现一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，有利于细胞单克隆的形成，避免了细胞需要对抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植和胚胎的发育质量起到了关键作用，同时不含有抗性基因，大大简化了生物安全评价过程。